當(dāng)前核酸藥物開發(fā)可分為化學(xué)改造和物理改性兩大方向，二者可單獨(dú)或共同提升核酸藥物體內(nèi)外穩(wěn)定性和特定組織、細(xì)胞內(nèi)的翻譯效率。目前已開發(fā)出多種核酸改造和遞送技術(shù)，主要包括化學(xué)修飾、配體偶聯(lián)和納米遞送載體。

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       納米遞送載體

       1、無機(jī)納米載體

       無機(jī)納米載體是以無機(jī)物為主體的遞送系統(tǒng)，常用的無機(jī)納米材料有金、銀、磷酸鈣、氧化石墨烯、量子點(diǎn)和磁性納米材料如氧化鐵等。無機(jī)納米材料因其獨(dú)特的電學(xué)、光學(xué)性質(zhì)和生物相容性以及低細(xì)胞毒性的特點(diǎn)而備受關(guān)注。金納米材料具有柔性表面，可以使核酸直接與金納米粒結(jié)合。有學(xué)者利用i-motif 二級(jí)結(jié)構(gòu)制作一種pH敏感的siRNA-金納米粒遞送系統(tǒng)，可通過siRNA沉默 PLK1（編碼穩(wěn)定染色體和有絲分裂所必需的酶），進(jìn)而誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。pH 梯度變化可引起核酸構(gòu)象改變，誘導(dǎo) siRNA-金納米粒聚集，促進(jìn)體內(nèi)逃逸，從而釋放 siRNA。干細(xì)胞難以攝取外來物質(zhì)，很難使用傳統(tǒng)的非病毒載體進(jìn)行藥物遞送。研究利用HIV-TAT肽對(duì)金納米粒和銀納米粒進(jìn)行功能化修飾，載體可以有效穿透表皮干細(xì)胞，且毒性較低。量子點(diǎn)是一種基于半導(dǎo)體的單分散納米晶體，碳量子點(diǎn)是其中最典型的應(yīng)用之一，其尺寸通常小于 10 nm，碳量子點(diǎn)具有低毒性、高量子產(chǎn)率、低光漂白、良好的水溶性、易于表面修飾和化學(xué)性能穩(wěn)定的特點(diǎn)。PEI、乙二胺、精胺和精氨酸等表面修飾已廣泛應(yīng)用于碳量子點(diǎn)，且攜帶陽離子化合物的碳量子點(diǎn)可以有效地將治療性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。碳量子點(diǎn)可用于癌癥靶向治療，利用葉酸修飾摻雜了氮的碳量子點(diǎn)，與自噬抑制劑組合，可實(shí)現(xiàn)快速（24 h內(nèi)）抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)且殺傷效果顯著。另外，碳量子點(diǎn)還可以作為一種高效的熒光探針，實(shí)現(xiàn)核酸標(biāo)記和體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布的實(shí)時(shí)跟蹤。例如用脂質(zhì)體包裹碳量子點(diǎn)可用于血管中腫瘤擴(kuò)增的成像，運(yùn)用碳量子點(diǎn)來遞送 siRNA 可進(jìn)行“可視化”的肺癌治療。石墨烯是碳的同素異形體，由于其獨(dú)特的光學(xué)、熱學(xué)和電學(xué)特性，成為一種新型納米材料。氧化石墨烯存在 π-π 堆疊非共價(jià)相互作用，可以提高藥物裝載能力并實(shí)現(xiàn)受控釋放。由PEG、PEI 和氧化石墨烯組成的一種刺激響應(yīng)型核酸遞送載體，氧化石墨烯納米粒吸收近紅外輻射時(shí)，局部溫度升高，導(dǎo)致內(nèi)體破裂，實(shí)現(xiàn)受控釋放。同時(shí)，氧化石墨烯具有較高負(fù)載力，可以將氧化石墨烯、PEI 和聚 4-苯乙烯磺酸鈉組裝成納米復(fù)合物來同時(shí)遞送 miRNA 藥物和抗癌藥物阿霉素。

       2、脂質(zhì)納米顆粒遞送系統(tǒng)

       基于脂質(zhì)的納米載體是核酸藥物遞送領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。脂質(zhì)本身即是細(xì)胞膜的主要成分，其易于與細(xì)胞膜的磷脂雙分子層相融合，可以提高納米載體的細(xì)胞攝入。而且，脂質(zhì)易于購(gòu)買、生物相容性好、可生物降解，還可以通過化學(xué)修飾提高載體靶向性。目前研究涉及的脂質(zhì)納米載體包括脂質(zhì)復(fù)合物（lipoplex）、脂質(zhì)聚合物復(fù)合物（lipopolyplex）、層狀納米顆粒（layer-by-layer nanoparticle，LbLNP）、固體脂質(zhì)納米粒（solid lipid nanoparticle，SLN）、納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（nanostructured lipid carrier，NLC），以及穩(wěn)定的核酸脂質(zhì)粒子（stable nucleic acid-lipid particle，SNALP）等。

       ①脂質(zhì)復(fù)合物。通過電性吸引將核酸藥物與陽離子脂質(zhì)，如溴化三甲基-2，3-二油酰氧基丙基銨（DOTAP）、氯化三甲基-2，3-二油烯氧基丙基銨（DOTMA）等混合后直接形成脂質(zhì)復(fù)合物是最簡(jiǎn)單的遞送思路。脂質(zhì)復(fù)合物的表面帶正電荷，便于結(jié)合帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜繼而進(jìn)入細(xì)胞，但其在體內(nèi)環(huán)境中會(huì)與帶負(fù)電荷生物大分子發(fā)生作用，導(dǎo)致帶負(fù)電荷的核酸藥物被置換從而發(fā)生泄漏，同時(shí)產(chǎn)生電荷相關(guān)的生理毒性。另外，脂質(zhì)復(fù)合物劑型穩(wěn)定性不理想，需要在使用前即時(shí)配制。

       ②脂質(zhì)聚合物復(fù)合物。脂質(zhì)聚合物復(fù)合物系將陽離子聚合物，如聚乙烯亞胺（PEI）、聚賴氨酸（PLL）、聚精氨酸、聚酰胺-胺樹形分子（PAMAM dendrimer）等與核酸藥物形成的表面帶正電的聚合物復(fù)合物通過電性吸引包裹脂質(zhì)雙分子層得到，形成的納米顆粒表面基本不帶正電荷。相較于脂質(zhì)復(fù)合物，脂質(zhì)體聚合物復(fù)合物可以顯著提高遞送效率，且穩(wěn)定性明顯提高。通過加入透明質(zhì)酸或肝素對(duì)復(fù)合物表面進(jìn)行修飾，其免疫刺激性可進(jìn)一步降低。

       ③層狀納米顆粒。層狀納米顆粒通過序列的電性作用將核酸藥物包裹進(jìn)多層的納米顆粒。中心穩(wěn)定的納米核心及各層材料的選擇對(duì)相鄰層之間的吸附至關(guān)重要。如使用電負(fù)性的聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）顆粒作為核心，首先將聚精氨酸（poly-L-Arg）吸附至核心表面以產(chǎn)生帶正電荷的表面，再以電負(fù)性的siRNA 進(jìn)行覆蓋，再覆蓋一層帶正電荷的聚精氨酸，最后用偶聯(lián)了 CD20 抗體的帶負(fù)電荷的透明質(zhì)酸覆層。該多層納米顆粒最外層的負(fù)電荷層可以避免產(chǎn)生正電荷相關(guān)毒性，其在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中未見明顯的毒性。但層狀納米顆粒的材料選擇要求較高且制備工藝復(fù)雜、重現(xiàn)性差，限制了其應(yīng)用。

       ④固體脂質(zhì)納米粒（SLN）和納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體。固體脂質(zhì)納米粒具有低熔點(diǎn)的固體陽離子脂質(zhì)核心，核酸藥物吸附于載體基質(zhì)表面，通過外圍的表面活性劑使之穩(wěn)定。但研究發(fā)現(xiàn)，SLN 可能會(huì)隨著內(nèi)部固體脂質(zhì)晶體的逐漸生長(zhǎng)導(dǎo)致藥物泄漏。納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體為其升級(jí)版本，在基質(zhì)中摻入少量的液體脂質(zhì)，降低了脂質(zhì)核心的結(jié)晶程度，不僅提高了載藥量，還具有更好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性。由于固態(tài)脂質(zhì)核也可進(jìn)行載藥，固體脂質(zhì)納米粒和納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體可以對(duì)親脂性藥物進(jìn)行遞送。使用固體脂質(zhì)納米粒對(duì)Bcl-2 siRNA 和紫杉醇同時(shí)包載，體外結(jié)果顯示這2種藥物可以同時(shí)釋放。

       ⑤穩(wěn)定的核酸脂質(zhì)粒子。穩(wěn)定的核酸脂質(zhì)粒子（SNALP）是一種含有可離子化陽離子脂質(zhì)的脂質(zhì)納米粒（LNP），由正電/可離子化脂質(zhì)、結(jié)構(gòu)脂質(zhì)、PEG 脂質(zhì)及膽固醇組成，可有效阻止核酸藥物在內(nèi)源性環(huán)境中的降解，將藥物遞送至細(xì)胞內(nèi)。基于其技術(shù)和商業(yè)上的成功導(dǎo)致的巨大影響，許多文獻(xiàn)中的LNP均特指SNALP。LNP粒徑通常為20～200 nm，該大小可幫助LNP 克服體液 (如血液和淋巴液) 的剪切并穿過組織間隙。研究表明，LNP 在體內(nèi)主要通過與載脂蛋白E (apoli‐poprotein E，ApoE) 形成復(fù)合物，在低密度脂蛋白受體介導(dǎo)的內(nèi)吞后由CLs/ILs 介導(dǎo)的內(nèi)體逃逸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。LNP 的體內(nèi)分布與處方及相關(guān)受體密切相關(guān)，LNP 的處方研究是當(dāng)前 RNA 遞送的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

       目前，已有3個(gè)使用此類遞送系統(tǒng)的產(chǎn)品獲批上市，分別為阿尼拉姆公司開發(fā)的治療遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性（hATTR）的 siRNA 藥物 patisiran（商品名：Onpattro），以及用于預(yù)防新冠病毒感染的mRNA疫苗 Comirnaty 和 Spikevax?？呻x子化陽離子脂質(zhì)的使用和微流控混合技術(shù)的出現(xiàn)使得載藥顆粒的表面基本不帶電?？呻x子化陽離子脂質(zhì)在酸性條件下帶正電荷，而在體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)的環(huán)境中幾乎不帶電。脂質(zhì)納米粒制備時(shí)，在pH 約4的條件下，通過快速混合脂質(zhì)的乙醇溶液和核酸的水溶液，可形成實(shí)心的脂質(zhì)顆粒。將其透析除去乙醇后，于近中性的水溶液中保存?zhèn)溆?，脂質(zhì)顆粒表面近中性。

       SNALP 通過一系列巧妙的設(shè)計(jì)獲得了商業(yè)上的成功，但其存在的問題也比較明顯。首先，其遞送效率有限，為達(dá)到治療效果需要較高的給藥劑量。但是，作為一種使用了多種脂質(zhì)輔料的注射劑，輔料的毒性不可忽視。另外，PEG 脂質(zhì)被報(bào)道可引起超敏反應(yīng)，陽離子脂質(zhì)也具有一定的促炎性。例如，Onpattro 在注射之前需要使用抗組胺藥和激素藥物控制。隨著同樣靶向肝臟的更高效遞送系統(tǒng)-N-乙酰半乳糖胺（N-acetylgalactosamine，GalNAc）偶聯(lián)遞送系統(tǒng)的出現(xiàn)，SNALP 已逐漸退出 siRNA遞送領(lǐng)域。但對(duì)于生物利用度更差、荷電更高的mRNA及CRISPR 基因編輯藥物，LNP遞送系統(tǒng)目前仍是解決其遞送難題最有效的方式。

       經(jīng)過近半個(gè)世紀(jì)的積累，遞送技術(shù)逐漸成熟，使核酸藥物進(jìn)入了快速增長(zhǎng)期。核酸藥物在治療遺傳性疾病方面具有天然優(yōu)勢(shì)，為眾多罕見病患者提供了寶貴的治療機(jī)會(huì)。核酸藥物遞送技術(shù)的發(fā)展呈現(xiàn)出平臺(tái)化的特點(diǎn)，在遞送技術(shù)相對(duì)成熟后，基于相同技術(shù)平臺(tái)開發(fā)類似藥物的速度會(huì)明顯加快。如借助前期脂質(zhì)納米粒的技術(shù)沉淀，Moderna公司的mRNA 新冠疫苗從疫苗序列選擇設(shè)計(jì)完成到首次人體給藥，合計(jì)僅耗時(shí)63 d，展現(xiàn)了超乎以往想象的效率。可以預(yù)見，已有的技術(shù)平臺(tái)未來也非常有希望應(yīng)用于體內(nèi)基因編輯等新的治療領(lǐng)域。同時(shí)，核酸藥物的遞送仍面臨眾多技術(shù)挑戰(zhàn)。如何進(jìn)一步提高遞送效率、降低遞送系統(tǒng)的毒性、實(shí)現(xiàn)對(duì)其他肝臟外組織和器官的特異性遞送將是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。伴隨著對(duì)核酸體內(nèi)作用機(jī)制和相關(guān)疾病認(rèn)識(shí)的進(jìn)一步深入，核酸藥物遞送系統(tǒng)必將迎來新的突破和發(fā)展，助力于提供安全有效的個(gè)性化治療方案，使更多患者受益。

       參考資料

       [1]陳歡，魏利軍.RNA藥物非病毒遞送系統(tǒng)研究進(jìn)展[J].藥學(xué)進(jìn)展，2022，46(11):

       [2]李丹，黃宇坤，高小玲.RNA藥物遞送研究進(jìn)展[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2023，58(03):

       [3]王峻峰，譚曼曼，王穎等.核酸類藥物的修飾和遞送研究進(jìn)展[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2023，52(04):

       作者簡(jiǎn)介：小米蟲，藥品質(zhì)量研究工作者，長(zhǎng)期致力于藥品質(zhì)量研究及藥品分析方法驗(yàn)證工作，現(xiàn)就職于國(guó)內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，從事藥品檢驗(yàn)分析及分析方法驗(yàn)證