隨著生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的野生新菌株被發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用。隨著基因工程和代謝工程等合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，重組菌的構(gòu)建和開發(fā)越來越高效，重組菌的應(yīng)用也越來越廣泛，更是有成為工業(yè)生物技術(shù)的主導(dǎo)趨勢。
基因工程是指將確定性能的外源基因與特定載體在體外重組，然后轉(zhuǎn)入目標(biāo)菌株，使其表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀。代謝工程是利用基因工程技術(shù)或其他物理化學(xué)方法對菌株的代謝途徑、通量進(jìn)行擴(kuò)展或增強(qiáng)、阻斷或減小，甚至構(gòu)建新代謝途徑的改造，從而提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量與效率，或合成新的代謝產(chǎn)物。重組菌分為兩種類型，一種是不含外源載體，基因組直接攜帶外源基因，這種表達(dá)一般相對穩(wěn)定，但因?yàn)槠洚a(chǎn)生的遺傳系統(tǒng)容易在重復(fù)DNA序列中觸發(fā)同源重組而失效導(dǎo)致不穩(wěn)定，且這種方式導(dǎo)入的外源基因拷貝數(shù)少。另一種是含有外源載體（通常是質(zhì)粒載體），具有很高的拷貝數(shù)所以目的基因可以通過載體攜帶實(shí)現(xiàn)高表達(dá)，但同時會產(chǎn)生質(zhì)粒穩(wěn)定性問題。所以重組菌的穩(wěn)定性是菌株改造與工業(yè)放大過程中需要直面的問題。
重組菌的不穩(wěn)定性又分為結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性和質(zhì)粒分離不穩(wěn)定性。基因組重復(fù)序列之間、質(zhì)粒載體位點(diǎn)之間的同源重組，宿主染色體及質(zhì)粒載體上IS因子和轉(zhuǎn)座子等轉(zhuǎn)座元件的插入作用、鄰位缺失或DNA重排，都有可能使基因組外源基因及質(zhì)粒載體產(chǎn)生自發(fā)突變，從而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性。此外，受體細(xì)胞的限制修飾系統(tǒng)對外源重組DNA分子的降解，外源基因過量表達(dá)時能量和物質(zhì)的匱乏以及表達(dá)產(chǎn)物的毒性作用誘導(dǎo)受體細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，激活核酸酶和蛋白酶對重組DNA分子的降解，也都會導(dǎo)致結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性。消除結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性的可用策略就是選用重組缺陷菌株作為宿主菌。
王瑩等(1)通過將布魯菌的per基因敲除，同時將帶有同源片段的打靶載體pMD19-T:kan電轉(zhuǎn)化布魯菌，利用體內(nèi)同源重組的方法，將kan抗性基因通過per兩側(cè)同源序列置換染色體上的待缺失區(qū)域，獲得布魯菌per基因重組菌，該重組菌能夠穩(wěn)定傳代培養(yǎng)至10代，Kan基因序列與per突變株第1代及第10代測序結(jié)果比對，同源性為100%，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果證明突變株培養(yǎng)1-10代均無回復(fù)突變。其結(jié)果證明，利用體內(nèi)同源重組方法構(gòu)建的布魯菌per基因突變株具有較好的遺傳穩(wěn)定性。
質(zhì)粒的分離不穩(wěn)定性是指在細(xì)胞分裂過程中的質(zhì)粒的隨機(jī)分配，與帶質(zhì)粒少的下代細(xì)胞生長負(fù)擔(dān)反而輕，導(dǎo)致質(zhì)粒因傳代丟失。質(zhì)粒拷貝分配到子細(xì)胞中的途徑可分為主動分配和隨機(jī)分配兩種方式。主動分配存在著有效的質(zhì)粒拷貝數(shù)控制系統(tǒng)，從而保證了質(zhì)粒的適度穩(wěn)定性。隨機(jī)分配過程中質(zhì)粒分離不穩(wěn)定性取決于無質(zhì)粒細(xì)胞的產(chǎn)生概率和細(xì)胞的比生長速率。
鮑張杰等(2)先分別構(gòu)建重組質(zhì)粒pETDuet-1-fdr-fdx及pACYCDuet-1-vdh，再將這兩個相容性質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，得到具有羥基化酶體系活性的重組大腸桿菌。采用IPTG對重組大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)，使其表達(dá)目的蛋白，利用SDS-PAGE檢測其蛋白大小及可溶性。采用液體傳代的方法研究質(zhì)粒穩(wěn)定性，初步得到重組大腸桿菌傳代培養(yǎng)30代，質(zhì)粒穩(wěn)定性高達(dá)99%，連續(xù)傳代培養(yǎng)到50代，質(zhì)粒穩(wěn)定性92%。證明該重組大腸桿菌具有較好的穩(wěn)定性。
郭晉霞等(3)利用畢赤酵母中的看家基因GAP（以單拷貝的形式存在）為內(nèi)參，采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線方法，提出了一種對重組畢赤酵母重組菌pPICZ-DT30/GS115（表達(dá)人胰島素前體(PI-DT30)）中外源基因DT30拷貝數(shù)的快速、準(zhǔn)確的熒光定量PCR檢測方法。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和值計(jì)算外源基因DT30在畢赤酵母重組菌中的拷貝數(shù)為7個。外源基因拷貝數(shù)是監(jiān)測目標(biāo)蛋白表達(dá)量能力的一個重要指標(biāo)，對畢赤酵母重組菌穩(wěn)定性的考察有重要意義。
重組菌反應(yīng)工程的前沿研究近年來也取得了些突破性的進(jìn)展。如Du Fei(4)等開發(fā)了一種快速構(gòu)建高性能重組菌的染色體多拷貝整合策略，首先利用非重復(fù)序列編碼計(jì)算器得到非重復(fù)序列作為表達(dá)元件，在此基礎(chǔ)上開發(fā)了對不同重組菌具有普適性的多拷貝整合方法；通過機(jī)器學(xué)習(xí)理性計(jì)算代謝途徑基因的最佳拷貝數(shù)組合，構(gòu)建了具有高遺傳穩(wěn)定性的解脂EPA（二十碳五烯酸）重組菌以及大腸桿菌（番茄紅素）重組菌。相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示了該策略在工業(yè)微生物中的廣泛適用性以及潛在應(yīng)用價值。
綜上，影響重組菌穩(wěn)定性的因素可以歸結(jié)為重組策略及宿主菌因素與質(zhì)粒自身因素。重組菌的穩(wěn)定性也關(guān)乎工藝研究的放大過程。培養(yǎng)過程中的比生長速率及外部環(huán)境，包括生長發(fā)酵時的培養(yǎng)條件，對重組菌的穩(wěn)定性有影響，還有細(xì)胞內(nèi)外源產(chǎn)物的積累也會對其穩(wěn)定性有一定影響。這一塊的理解及應(yīng)對策略有待下回分解。
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1. 王瑩, 安瀟瀟, 王健, 王芃, 黃芳, 周建光, et al. per基因突變對布魯菌穩(wěn)定性的影響. 生物技術(shù)通訊. 2016;27(2):204-7.
2. 鮑張杰, 陳向東, 汪輝, 任聰, 練家惠. 具有羥基化酶體系活性的重組大腸桿菌的構(gòu)建. 藥物生物技術(shù). 2019(2):95-9.
3. 郭晉霞, 何云鳳, 范開. 熒光定量PCR法檢測重組畢赤酵母工程菌的外源基因拷貝數(shù). 重慶理工大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版. 2016;30(2):77-83.
4. Du F, Li Z, Li X, Zhang D, Zhang F, Zhang Z, et al. Optimizing multicopy chromosomal integration for stable high-performing strains. Nature Chemical Biology. 2024.
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