大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌,屬于安全的重組菌類,因為其分子遺傳學(xué)背景清楚,代謝可塑性強,異源蛋白表達效率高,且繁殖迅速、培養(yǎng)工藝簡單成熟,容易實現(xiàn)高密度發(fā)酵等優(yōu)點,長期以來是科學(xué)研究與工業(yè)生產(chǎn)的常用重組菌之一。大腸桿菌宿主菌應(yīng)用較成熟的有:BL21系列、JM109系列、W3110系列和K802系列等,常用的啟動子有Ptrp、Ppho、PL、PR、Plac等,質(zhì)粒如pET、pBV220、pRK1、pRLK14等(1)。
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影響重組大腸桿菌穩(wěn)定性的因素有重組策略,重組元件即宿主菌、載體質(zhì)粒與外源基因。是在現(xiàn)有途徑中做代謝流修改還是直接另起爐灶開辟新的代謝流,是重組策略;是將外源基因直接插入染色體還是采用載體質(zhì)粒攜帶,是重組策略;是采用單一大質(zhì)粒一次轉(zhuǎn)入還是采用兩個獨立的小質(zhì)粒分步轉(zhuǎn)入,甚至基因間的不同排序與組合,也是重組策略;如何誘導(dǎo)表達也是重組策略。選用哪個已知的外源基因序列,選用哪個載體質(zhì)粒,選用哪個宿主菌,是重組元件的選擇。一般選用稀有密碼子較少的,GC含量稍低的,表達的蛋白酶專一性合適的外源基因序列;一般選用具有合適拷貝數(shù),合適啟動子與終止子的載體質(zhì)粒;一般選用適合酶的內(nèi)外分泌,利于酶與起始物及中間體接觸的,重組蛋白不易受大腸桿菌內(nèi)源性蛋白酶降解的底盤作為宿主菌。重組策略與重組元件選擇都屬于分子級內(nèi)容,這是重組大腸桿菌的根本。不同的重組結(jié)果得到表達的酶的活力、穩(wěn)定性完全不同,這也就造就了重組菌不同的代謝效率與代謝穩(wěn)定性。
影響重組大腸桿菌穩(wěn)定性的因素還有發(fā)酵策略,發(fā)酵方式與培養(yǎng)控制條件。在發(fā)酵產(chǎn)物為小分子油性物質(zhì)時,使用不能代謝的油性類似物作為萃取劑,加入發(fā)酵體系中萃取細胞內(nèi)產(chǎn)物,降低重組菌細胞內(nèi)產(chǎn)物積累,促使產(chǎn)物持續(xù)高強度合成屬于發(fā)酵策略;指數(shù)生長期前后采用誘導(dǎo)劑啟動誘導(dǎo),或者是在產(chǎn)物積累后期采用升溫轉(zhuǎn)化,也屬于發(fā)酵策略。是采用滲透提取的連續(xù)發(fā)酵還是采用分批(補料)發(fā)酵,是發(fā)酵方式的選擇。發(fā)酵培養(yǎng)過程中的溫度、pH、殘?zhí)?,及種子量、基礎(chǔ)培養(yǎng)基與補料控制屬于培養(yǎng)控制條件范疇。一般溫度過高,比生長速率較高,外源基因片段易變異,外源質(zhì)粒異丟失,而溫度過低呢,又影響前體的產(chǎn)生與體系整體能量的供給;一般低pH控制體系的乙酸濃度與銨離子濃度都相對較低,利于異源酶的表達與代謝活性,而pH過低呢又不利于多數(shù)酶促反應(yīng);一般地在發(fā)酵早期,低葡萄糖濃度條件下,乙酸可以再被利用,但過低的碳氮比又會影響代謝流,且更不利于帶質(zhì)粒重組菌的生長。種子量、基礎(chǔ)培養(yǎng)基與補料等,通過培養(yǎng)過程中的比生長速率不同而影響重組大腸桿菌的穩(wěn)定性,都需控制在合適范圍內(nèi)。
發(fā)酵時控制重組大腸桿菌不穩(wěn)定性,重要的是對重組菌的一些選擇策略。如首選將外源基因直接整合到宿主的染色體上,從根本上消除質(zhì)粒不穩(wěn)定性的重組菌進行放大;如選用在質(zhì)粒載體中引入質(zhì)粒丟失細胞的條件致死基因,可有效殺死質(zhì)粒丟失的空載細胞的重組菌;選用在外源基因表達系統(tǒng)構(gòu)建過程中引入可控的復(fù)制子和啟動子,以減少減少由于重組分子大量擴增及目的產(chǎn)物過量表達對受體細胞正常代謝的干擾的重組菌等。
提高重組大腸桿菌的發(fā)酵水平,需要首先考慮并控制重組大腸桿菌的穩(wěn)定性,在培養(yǎng)過程中通過控制誘導(dǎo)水平和細胞比生長速率而提升重組菌的穩(wěn)定性。再通過提高重組菌生長OD和提高單位菌體生產(chǎn)強度來提高大腸桿菌的發(fā)酵水平(2),這也是合成生物學(xué)菌株改造后篩菌選菌的表觀指標。即在選菌之初就選擇OD生長較高的、單位菌體生產(chǎn)強度較大、穩(wěn)定性較好的重組菌株。再改善影響條件和優(yōu)化發(fā)酵工藝后提高重組大腸桿菌的發(fā)酵產(chǎn)出。
參考文獻:
1. <重組大腸桿菌發(fā)酵表達及代謝調(diào)控研究進展.pdf>.
2. <基因工程重組大腸桿菌發(fā)酵生物量產(chǎn)出的影響因素評估.pdf>.
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