透皮傳遞能將藥物直接輸送到血液中，有效克服口服、注射等傳統給藥方式的弊端，從而成為藥物傳遞的一種重要方式。大多數藥物并不具備強透皮能力，借助載體透皮成為主要的藥物輸送方式，因此具有透皮傳導能力的透皮介導肽展示出了廣闊的應用前景。

       根據來(lái)源不同，透皮介導肽可分為 3類(lèi)：蛋白質(zhì)來(lái)源的透皮介導肽、基因重組來(lái)源的 透皮介導肽和人工設計合成的透皮介導肽。

       1、蛋白質(zhì)來(lái)源的透皮介導肽

       蛋白質(zhì)來(lái)源的透皮介導肽是由天然蛋白質(zhì)或其片段衍生而來(lái)的短肽，這些肽具有獨特的氨基酸序列和結構特性，使其能夠穿透細胞膜，而且通常具有較低的免疫原性，不易引起免疫反應。

       ①TAT-PTD是最早發(fā)現的細胞穿膜肽。研究發(fā)現人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV-1）的TAT蛋白可以被細胞跨膜攝取并轉移到細胞核中。自然界中這類(lèi)天然存在的多肽能夠安全有效地實(shí)現外源生物大分子的跨膜轉導，被稱(chēng)為蛋白質(zhì)轉導結構域（PTD）家族。TAT中含有一個(gè)與蛋白轉導功能密切相關(guān)的多肽片段（富含堿性氨基酸且帶正電荷），進(jìn)一步研究證實(shí)，TAT中第47～57位的11個(gè)氨基酸殘基（YGRKKRRQRRR）可獨立穿過(guò)多種類(lèi)型的細胞膜，穿膜效率比全長(cháng)TAT還要高，于是此段肽鏈被歸為T(mén)AT蛋白轉導結構域（TAT-PTD）。TAT-PTD可遞送雙氯芬酸鈉、熱休克蛋白P20、人類(lèi)酪氨酸酶質(zhì)粒、鹽酸利多卡因（LID）、降鈣素和塞來(lái)昔布等藥物進(jìn)入皮膚，并發(fā)揮良好的治療作用。

       ②來(lái)源于果蠅觸角蛋白異型的轉錄調節蛋白ANTP也是經(jīng)典的細胞穿膜肽之一，ANTP由60個(gè)氨基酸序列組成，包含3個(gè)α-螺旋結構，其中第3螺旋結構中的16個(gè)氨基酸多肽片段（43～58位）在蛋白轉導中發(fā)揮著(zhù)關(guān)鍵作用，目前，ANTP已實(shí)現商品化，即Penetratin。Penetratin可有效增強卵清蛋白（OVA257～264、OVA8）的穿透皮膚表面能力，從而引發(fā)高水平的OVA 特異性CD8+T細胞應答。Penetratin 修飾的微乳能顯著(zhù)增加紫杉醇活性表皮層和真皮層的沉積量。

       除了廣泛應用的TAT-PTD和ANTP等細胞穿透肽，其它的一些來(lái)自于生物體的細胞穿透肽也被發(fā)現具有透皮能力。低分子量魚(yú)精蛋白（LWMP）是天然魚(yú)精蛋白通過(guò)酶消化產(chǎn)生的肽片段。LWMP成本低、易于批量生產(chǎn)，是目前研究比較廣泛的細胞穿膜肽。LMWP 與 TAT-PTD 具有顯著(zhù)的結構相似性，其結構也有10個(gè)精氨酸殘基，與TAT-PTD 的促滲機制也相似。LMWP與卵清蛋白結合后，可以顯著(zhù)提高卵清蛋白穿透皮膚的能力。LMWP 修飾的聚乙烯亞胺/DNA 復合物（PEI/DNA）納米粒的皮膚累積透過(guò)量明顯優(yōu)于未修飾的 PEI/DNA納米粒。此外，從家蠶的 30kc19蛋白中發(fā)現的 Pep-c19，人源蛋白中得到的 IMT-P8和來(lái)源于非洲爪蟾皮膚的蛙皮素，人類(lèi)蛋白磷酸酶中發(fā)現的 Mgpe-9，從人類(lèi)轉錄因子中鑒別出的Hph-1-PTD等蛋白質(zhì)來(lái)源的細胞穿膜肽同樣具有促進(jìn)透皮吸收的作用。

       2、基因重組來(lái)源的透皮介導肽

       蛋白質(zhì)轉導結構域（PDT）為開(kāi)發(fā)新型透皮介導肽提供了一種高效手段。它將外源肽的編碼基因插入噬菌體（通常是M13、T4或 T7噬菌體）的外殼蛋白基因中，構建噬菌體展示文庫。噬菌體展示文庫可以包含大量不同的肽序列，增加篩選成功的可能性。基于PDT發(fā)現的透皮介導肽主要通過(guò)“生物淘洗法”得到。通常其流程是先將噬菌體顆粒應用到活體/離體皮膚上，再收集、擴增可以穿透皮膚的噬菌體，將這些可以穿透皮膚的噬菌體再次應用到皮膚上。經(jīng)過(guò)幾輪篩選后，通過(guò)穿透噬菌體的基因組 DNA 測序，鑒定可以持續穿透進(jìn)入皮膚的肽序列。經(jīng)篩選鑒定的肽通過(guò)透皮實(shí)驗進(jìn)一步評價(jià)其促滲效果。其優(yōu)勢主要體現在，可從數以?xún)|計的氨基酸序列中篩選出目標肽透皮介導肽，實(shí)現高通量篩選。但是，找到高效穿透皮膚屏障的肽序列可能需要多輪篩選和優(yōu)化，過(guò)程耗時(shí)較長(cháng)。篩選得到的肽序列通常生物相容性較好，但在實(shí)際應用中仍需評估其潛在的免疫原性和毒性。

       ①TD-1（ACSSSPSKHCG）是利用體內PDT篩選得到的具有11個(gè)氨基酸由二硫鍵成環(huán)的短肽，是第一個(gè)被報道能通過(guò)經(jīng)皮給藥途徑有效攜帶蛋白質(zhì)藥物（胰島素）的透皮介導肽。TD-1具有序列特異性和濃度依賴(lài)性，缺失其中的某些氨基酸都會(huì )降低透皮速率，并且隨著(zhù) TD-1濃度的升高，透皮增強效果也隨之提高。

       ②SPACE肽和DLP是使用離體豬皮進(jìn)行 PDT篩選所得，其可以同時(shí)增強大分子穿透表皮和真皮細胞膜活性。研究表明，這2個(gè)多肽在人體皮膚、小鼠皮膚、豬皮上均可實(shí)現高效穿透，其中關(guān)于SPACE肽研究開(kāi)展的更加廣泛，例如 siRNA、環(huán)孢素A、透明質(zhì)酸等的遞送。

       此外，線(xiàn)性肽T2（LVGVFH）和七肽 DRTTLTN均能發(fā)揮促滲作用。

       3、人工設計合成的透皮介導肽

       人工設計合成的透皮介導肽是根據天然蛋白質(zhì)和基因重組來(lái)源透皮介導肽的特點(diǎn)設計得到的新透皮介導肽。該方法不受限于天然肽或蛋白質(zhì)的序列，可以探索新的序列組合和功能，提高創(chuàng )新性。較早發(fā)現的天然來(lái)源細胞穿膜肽（如 TAT、ANTP）的一個(gè)典型特征是其中含有高濃度的精氨酸或者其他堿性帶正電的氨基酸。聚精氨酸（Rn）在進(jìn)入細胞時(shí)比賴(lài)氨酸、鳥(niǎo)氨酸或組氨酸組成的類(lèi)似長(cháng)度聚合物更有效，這表明精氨酸在穿透細胞膜過(guò)程中起著(zhù)重要的作用。

       ①聚精氨酸（R7）應用到皮膚滲透研究中，可以提高環(huán)孢素A的跨皮膚轉運。聚精氨酸的皮膚滲透深度取決于施用精氨酸的數量和濃度。比較不同數量精氨酸的序列增強納米脂質(zhì)載體促進(jìn)皮膚滲透的能力發(fā)現，精氨酸數量從8增加到11時(shí)，皮膚滲透能力增強；精氨酸數量從1增加到15時(shí)，皮膚滲透能力降低，這被歸因于精氨酸的長(cháng)度導致的飽和效應或空間位阻。不過(guò)，不同藥物可能需要不同長(cháng)度的聚精氨酸。例如，R4顯著(zhù)提高三肽-1（甘氨酰-組氨酰-賴(lài)氨酸，GHK）的滲透率；R6連接免疫蛋白OVA 應用到雄性小鼠皮膚上，增強了抗原特異性抗體的誘導；TD-1與R8聯(lián)用可促進(jìn) MITF-siRNA 皮膚滲透，顯著(zhù)抑制黑色素合成；R9 可提高綠色熒光蛋白（GFP）和胰島素的皮膚滲透；R11 修飾的塞來(lái)昔布納米結構脂質(zhì)載體比未修飾載體有更高的透皮效率。此外，還有一些含有精氨酸殘基的肽具有皮膚促滲作用，如 R5H3、R8H3等。

       ②利用賴(lài)氨酸雙取代TD-1的N-5和N-6位得到的TD-34（ACSSKKSKHCG）顯示出良好的促滲活性。由于透皮介導肽容易被蛋白水解酶降解，近年來(lái)開(kāi)發(fā)了多種增強透皮介導肽穩定性的方法。其中最穩定和可靠的方法是N-乙酰化和C-酰胺化。TDN（ACSSKKSKHCG-NH2）是在TD-1的 C末端酰胺化修飾獲得的，TDN 的穩定性明顯高于TD-1。將TD-34的 N-1和N-2氨基酸進(jìn)行取代，且C末端進(jìn)行酰胺化，合成線(xiàn)性肽DL-2（KWSSKKSKHCG-NH2）和環(huán)狀肽DLCC-2（KCSSKKSKHCG-NH2）在皮膚中能維持相對穩定的有效透皮介導肽濃度，促進(jìn)藥物的皮膚吸收。

       ③Pep-1是利用細胞穿膜肽的兩親特性設計的嵌合肽，該肽可將各種多肽和蛋白質(zhì)以完全生物活性的形式有效地輸送到幾個(gè)細胞系中，無(wú)需與載荷蛋白進(jìn)行化學(xué)共價(jià)連接或使載荷蛋白發(fā)生變性。Pep-1由富含色氨酸的疏水性氨基序列（KETWWETWWTEW）和富含賴(lài)氨酸親水性結構域（KKKKV）以及分隔2個(gè)結構域的間隔區（WSQP）組成。Pep-1 可與肉毒桿菌神經(jīng)毒素結合進(jìn)入小鼠皮膚，有效滲透到表皮和真皮；Pep-1也可與超氧化物歧化酶（SOD）融合，轉導到皮膚組織中，實(shí)現對缺血性腦損傷的有效治療。

       人工設計合成的透皮介導肽具有高度可定制化、無(wú)天然限制和精確控制等優(yōu)點(diǎn)，使其在藥物遞送和生物醫學(xué)應用中具有巨大潛力。然而在實(shí)際研發(fā)過(guò)程中，需要克服成本高、設計復雜性以及潛在的生物相容性問(wèn)題等限制和不足。

       促滲作用機制

       目前關(guān)于透皮介導肽轉導載荷進(jìn)入細胞的機制研究存在著(zhù)諸多矛盾之處。對已經(jīng)報道的代表性透皮介導肽的研究發(fā)現，存在于它們之間的唯一共同特征是兩親性和帶正電荷。在正常生理條件下，皮膚帶負電荷，而皮膚真皮層和角質(zhì)層也分別呈現親水性和親脂性差異。從皮膚特性來(lái)講，兩親性和陽(yáng)離子似乎也正是透皮所要求的基本條件。

       ①表面正電荷屬性推動(dòng)透皮介導肽吸附到皮膚表面。對于透皮介導肽一級結構的分析證實(shí)了表面電荷對于透皮能力的影響。就自然屬性和界面位置來(lái)看，正負電荷之間的相互作用是透皮介導肽進(jìn)入皮膚的第一步，正負電荷相吸作用推動(dòng)了透皮介導肽吸附到皮膚表面上來(lái)，且陽(yáng)離子特性越強，接觸面積越大，吸附性也越強。

       ②透皮介導肽通過(guò)擾亂細胞間脂質(zhì)結構或角蛋白結構透過(guò)角質(zhì)層。角質(zhì)層中不管是細胞內傳遞路徑還是細胞間傳遞路徑，由于存在著(zhù)層間傳遞，即使親水性物質(zhì)也必須通過(guò)下一層的細胞間脂質(zhì)，才能到達細胞內，因此細胞間脂質(zhì)實(shí)際上就成為外來(lái)物質(zhì)傳遞的主要限速結構。 目前，大多數研究?jì)A向于透皮介導肽通過(guò)擾亂細胞間脂質(zhì)的有序結構而通過(guò)角質(zhì)層，也有一些研究認為，透皮介導肽穿過(guò)細胞間脂質(zhì)并不簡(jiǎn)單是由于脂質(zhì)結合而導致的擾亂作用，而是認為透皮介導肽能夠使角質(zhì)層中角蛋白構象由β-折疊向α-螺旋轉變，從而擾亂角蛋白結構，造成通透性。

       ③精氨酸頭部胍基主宰與真皮層細胞膜表面結合。透皮介導肽及其載荷穿過(guò)角質(zhì)層后，在 真皮層細胞中，共軛的載體肽和載荷藥物穿過(guò)脂質(zhì)細胞膜進(jìn)入細胞質(zhì)中，同角質(zhì)層中細胞間脂質(zhì)一樣，膜脂結構也是入胞的主要障礙，精氨酸的胍基頭部這時(shí)起到了重要作用。陽(yáng)離子透皮介導肽中的精氨酸頭部胍基是入胞的關(guān)鍵功能組分，細胞膜表面硫酸多糖在細胞表面形成電負性池，吸引帶正電荷的精氨酸頭部胍基，兩者緊密結合；同時(shí)細胞膜的磷酸基團、硫酸基團與精氨酸殘基的頭部胍基基團形成配位氫鍵，促使胍基進(jìn)一步結合到細胞膜表面。

       ④胞吞作用使外界物質(zhì)進(jìn)入細胞內。多數研究者傾向于真皮層細胞通過(guò)胞吞作用攝取透皮介導肽及其載荷進(jìn)入細胞內，而且受濃度、載荷種類(lèi)、細胞類(lèi)型等影響，對于陽(yáng)離子透皮介導肽，巨細胞胞飲為主要細胞攝取形式。

       ⑤細胞退出機制實(shí)現透皮介導肽及其載荷的逐層傳遞，最終到達真皮層。如果外界物質(zhì)是通過(guò)進(jìn)入細胞而實(shí)現傳遞，那就必然存在一個(gè)物質(zhì)從細胞退出的機制，否則無(wú)法在真皮層以及血液中得到想要傳遞的物質(zhì)。研究已經(jīng)證實(shí)，細胞退出機制在透皮介導肽攜帶載荷傳遞中的作用。

       ⑥皮膚物理屬性等其它調控因素對于透皮的影響。除去細胞間途徑和細胞內途徑外，透皮介導肽傳遞的第3條途徑皮膚附屬器官通道對于傳遞機制也會(huì )產(chǎn)生一定的影響。一般認為皮膚厚度可能會(huì )影響透皮吸收效率，而對于膚厚度與經(jīng)皮吸收之間的研究發(fā)現，皮膚厚度與不同動(dòng)物經(jīng)皮吸收能力之間并沒(méi)有直接的關(guān)聯(lián)，α-促黑激素（α-MSH）能夠透過(guò)人和小鼠腹部皮膚，促進(jìn)毛發(fā)和皮膚變黑，卻難以透過(guò)大鼠皮膚，而人在某些部位的皮膚厚度與大鼠相當。由此表明不同透皮化合物對不同實(shí)驗動(dòng)物在經(jīng)皮吸收方面存在著(zhù)巨大的差異，很難由一種動(dòng)物模型推斷出另一種動(dòng)物的吸收特性。

       參考資料

       [1]龔魁杰,石愛(ài)民,劉紅芝,等.透皮介導肽及其經(jīng)皮吸收機制研究進(jìn)展[J].中國食品學(xué)報,2017,17(04):165-173.

       [2]黃鈺卿,王宇岐,丁平田,等.透皮介導肽的研究進(jìn)展[J].藥物評價(jià)研究,2024,47(07):1653-1668.

       作者簡(jiǎn)介：小米蟲(chóng)，藥品質(zhì)量研究工作者，長(cháng)期致力于藥品質(zhì)量研究及藥品分析方法驗證工作，現就職于國內某大型藥物研發(fā)公司，從事藥品檢驗分析及分析方法驗證