重組蛋白藥物是生物藥物中的核心產(chǎn)品，主要是通過基因工程菌來生產(chǎn)功能蛋白或其突變體，用于彌補體內(nèi)蛋白的缺失，從而對疾病的治療發(fā)揮關鍵作用。近年來，重組蛋白藥物在疾病治療中發(fā)揮作用越來越大，相關技術也發(fā)展迅速。重組蛋白藥物種類繁多，包括多肽藥物、基因工程藥物、重組蛋白疫 苗、抗體類藥物等。相較于傳統(tǒng)藥物，重組藥物活性、特異性均更高，且毒 性低，更加安全有效。目前，市場上重組蛋白藥物表現(xiàn)為胰島素、激素、人造血因子、尼妥珠單抗等，臨床應用廣泛。重組蛋白藥物的整體產(chǎn)業(yè)鏈分為上、中、下游，其中上游是基于基因工程技術、細胞工程技術的研發(fā)環(huán)節(jié)，中游為藥物及給藥系統(tǒng)生產(chǎn)制造，包括大規(guī)模細胞培養(yǎng)、重組蛋白純化與質(zhì)控。

       1、重組蛋白藥物生產(chǎn)的表達系統(tǒng)

       目前在工業(yè)應用中，涉及到多種重組表達系統(tǒng)，其中在生產(chǎn)重組蛋白藥物中，主要應用大腸桿菌、酵母和哺乳動物 CHO 細胞系 3 種表達系統(tǒng)。在3種表達系統(tǒng)中，大腸桿菌系統(tǒng)最為簡單。此系統(tǒng)涵蓋多種類型的菌株，這些菌株的主要差異在于篩選標記、誘導方式、有無信號序列、營養(yǎng)缺陷型及特殊蛋白質(zhì)折疊機制。對于大腸桿菌的基因工程改造更好地完善了大腸桿菌表達系統(tǒng)，如編碼二硫鍵異構(gòu)酶的基因已穩(wěn)定整合到大腸桿菌的基因組中，確保蛋白正確折疊，提高胞內(nèi)蛋白的折疊和溶解性。重組蛋白在大腸桿菌周質(zhì)空間中的有效分泌可提高大腸桿菌表達的蛋白可溶性。大腸桿菌表達系統(tǒng)主要用于多肽類藥物的生產(chǎn)，如重組人胰島素和重組甲狀旁腺激素等。

       酵母系統(tǒng)主要包括釀酒酵母和畢赤酵母，此外還包括一些非傳統(tǒng)的酵母種類，如漢森菌多形酵母、脂酵母、裂殖酵母和乳酸克魯維酵母菌也已發(fā)展為合成各種不同特性蛋白藥物的宿主。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是廣泛研究的酵母表達系統(tǒng)之一，用于生物制藥合成的宿主。糖基化是重要的翻譯后修飾之一，盡管酵母可以進行N?糖基化和O?糖基化，但與人源細胞的糖基化模式有顯著差異，其分泌的重組蛋白會形成α?1，3?甘露糖化，導致蛋白免疫原性增加、半衰期縮短。通過在酵母中準確引入人源糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶，刪除超甘露糖化基因，可以使酵母糖基化途徑與人糖基化途徑相似，從而保證治療蛋白的藥代動力學特性。畢赤酵母（Pichia pastoris）生長快，發(fā)酵細胞濃度高，可產(chǎn)生大量重組人源蛋白。畢赤酵母系統(tǒng)能夠靈活地選擇合適的載體和兼容宿主，高效、經(jīng)濟地表達重組蛋白，保證產(chǎn)品成功開發(fā)。

       CHO 細胞系是一種來源于中國倉鼠卵巢的上皮細胞系，能夠產(chǎn)生人同源性蛋白。人體組織纖溶酶原激活劑是1986 年第一個在 CHO 細胞系中成功生產(chǎn)并批準臨床使用的重組治療蛋白。隨后，越來越多的治療性蛋白質(zhì)在哺乳動物細胞中被制造出來，并且隨著工藝的優(yōu)化，在該表達系統(tǒng)中生產(chǎn)重組蛋白的技術得到了迅速發(fā)展。

       在廣泛篩選表達系統(tǒng)時，蛋白的高表達量、翻譯后修飾質(zhì)量和遺傳穩(wěn)定性是主要的標準。不同的表達系統(tǒng)具有各自的優(yōu)缺點，需要根據(jù)產(chǎn)品的特性選擇合適的系統(tǒng)和宿主。優(yōu)勢宿主的篩選是生產(chǎn)異源蛋白的關鍵步驟。在選擇優(yōu)勢宿主時，通常采用高通量篩選技術，這種技術的出現(xiàn)徹底改變了宿主篩選技術領域，通過使用 96 深孔板或類似技術對多個批次實驗進行平行篩選，提高了宿主的篩選效率。最終選擇的宿主要在產(chǎn)品質(zhì)量、滴度、特定生產(chǎn)率、工藝可行性、預期的電荷變體和糖基化配置、沒有或較少的聚集形成和克隆穩(wěn)定性上滿足標準。

       2、細胞培養(yǎng)

       在選擇好最 佳宿主后，下一個重要環(huán)節(jié)是細胞培養(yǎng)的開發(fā)。為了更好的控制和優(yōu)化細胞培養(yǎng)過程，開發(fā)了各種新的技術和工具。通常，在宿主發(fā)酵生產(chǎn)蛋白藥物時，通過優(yōu)化培養(yǎng)基、溫度、pH、接種量和生產(chǎn)動力學等參數(shù)來提高蛋白質(zhì)的合成。生物量增長率是促進產(chǎn)品合成的關鍵因素，對于補料分批生產(chǎn)技術至關重要，某些醫(yī)藥公司將宿主細胞增長率保持在小于最大增長率的特定值，通過補料來控制宿主細胞以特定增長率生長。不過，近年來制藥行業(yè)越來越關注通過將分批生產(chǎn)轉(zhuǎn)變到連續(xù)生產(chǎn)來提高生物合成效率。

       在發(fā)酵工具上，使用自動化控制的一次性生物反應器系統(tǒng)是當今生物制藥公司的一個新趨勢。與傳統(tǒng)的不銹鋼系統(tǒng)相比，一次性系統(tǒng)投資成本和操作成本更低，生產(chǎn)周期更短，靈活性更好，大大減少了污染的幾率。這些一次性生物反應器及其附件可從50L擴大到2000 L的規(guī)模。從細胞工程到細胞培養(yǎng)方法的創(chuàng)新開發(fā)，使得單克隆抗體的產(chǎn)量從50 mg·L-1提高到5~20 g·L-1。

       3、重組蛋白藥物分離純化

       通過優(yōu)化好的細胞上游培養(yǎng)工藝，特定的表達系統(tǒng)會產(chǎn)生大量的重組藥物蛋白，其中還包含一些宿主本身的蛋白、核酸等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)可能對人體產(chǎn)生不利的生物活性。因此，對藥品的純度要求非常嚴格，這就需要對產(chǎn)品蛋白進行精度純化。此環(huán)節(jié)是重組藥物蛋白制備技術的關鍵，是決定蛋白藥物品質(zhì)的核心。單克隆抗體或任何其他蛋白（包括重組酶）一般是通過各種過濾步驟和色譜層析等技術進行純化的。色譜法是純化有價值產(chǎn)品最合適的技術，許多成熟的色譜方法已經(jīng)應用到實際的生物制藥生產(chǎn)中。

       細胞培養(yǎng)完成后，離心、大孔徑切向流過濾和深度過濾是用于初級細胞澄清的常用技術，深度過濾和生物減重過濾器有助于二次澄清過程。不同的表達系統(tǒng)可能會有不同的分泌部位，導致收集方式不同。如在大腸桿菌中表達的重組蛋白通常以包涵體的形式積累，需要回收后在體外重新折疊這些蛋白質(zhì)，使其具有生物活性。

       由于蛋白藥物混合物中含有大量不同化學性質(zhì)的雜質(zhì)，單一的色譜技術往往不足以獲得良好的分離。傳統(tǒng)的重組蛋白藥物純化工藝，是在收獲澄清后進行超濾濃縮，隨后進行逐級的單柱色譜分離純化，在充分了解目標蛋白和雜質(zhì)的理化性質(zhì)后，盡量減少純化步驟，一般分離純化不超過4步。隨著技術的發(fā)展，一種創(chuàng)新的固定相被開發(fā)出來，其結(jié)合了兩種分離機制（反相或HILIC和離子交換），形成一種混合模式的純化方式。考慮到蛋白藥物混合物通常需要結(jié)合基于多種不同分離原理的色譜技術來提高分辨率，從而產(chǎn)生多維色譜分離技術。在線多維色譜中，從第一根色譜柱流出的產(chǎn)物會立即注入第二根色譜柱，并加快分析時間。通常，在分離過程中，質(zhì)譜與多維色譜聯(lián)用可提高純度。

       近年來，為了處理復雜生物分子混合物的純化，又開發(fā)了一種稱為多柱逆流溶劑梯度純化（MCSGP）技術。MCSGP技術的原理是流動相相對于固定相逆流運動，通過一系列切換閥進行模擬，使整個過程實現(xiàn)循環(huán)和自動化。使用MCSGP 技術可以使目標蛋白和雜質(zhì)之間的重疊峰在內(nèi)部循環(huán)，以便再加工，并且可以使用溶劑梯度進行洗脫。這種技術已被用于多個需要加強純化的案例中，如單克隆抗體、寡核苷酸、大 麻二酚和多肽的純化。

       4、重組蛋白藥物的藥效延長方法

       重組蛋白藥物相較于一般藥物具有特殊性，目前，提高重組蛋白藥物效果的研究方法主要基于如下3 種原理產(chǎn)生，第一，提高藥物蛋白分子量，降低腎小球過濾；第二，借助游離型或者結(jié)合型藥物，維持血漿平衡，減緩藥物釋放；第三，降低異源蛋白免疫原，以有效降低藥物釋放率。基于以上3 種原理出現(xiàn)了以下延長藥效的方法。

       ①構(gòu)建突變體：采用構(gòu)建突變體延長藥物半衰期的方法主要如下：第一，提升藥物糖基化度，以此增加藥物表面?zhèn)孺?，提升蛋白質(zhì)平穩(wěn)度，防止蛋白酶快速降解藥物；第二，提高藥物分子量，避免腎小球過濾，延長游離型藥物作用時間?；谏鲜鰞煞N方法目前存在下述研究：第一，重組人促紅細胞生成素（EPO）存在1個O與3個N 糖基化位點。O是否糖基化與人體活性關系以及清除速度關系不大，但是N如果不完全重組則會影響人體活性，會導致體內(nèi)活性降低。即是說，N 糖基化更為重要，它能夠維持活性同時降低清除率。第二，研究基于大腸桿菌的K12株發(fā)現(xiàn)，基于人胰島素A-21位點下的反應Asp 變?yōu)榱薌ly，在B-30位點下的反應使得 PI-pH4.0變?yōu)榱藀H6.7。該突變能夠形成澄清溶液，進入人體后鑒于其電解特點，可以轉(zhuǎn)化成難溶物質(zhì)，并持續(xù)釋放，溶于血液，長時間保持平穩(wěn)，沒有尖峰，由原來的4-8h藥效延長至24h以上，由每日3次的給藥變?yōu)槊咳?次。

       ②PEG 化修飾：聚乙二醇共價修飾蛋白質(zhì)即為 PEG 化修飾。采取提升蛋白質(zhì)分子量的方式降低藥效流失，將 PEG 作為屏障隔離蛋白質(zhì)分子表面反應，降低免疫原性，降低藥物流失速度，同時保護蛋白質(zhì)不被水解。PEG 的上述作用可以大大提升藥物抗衰期時間。目前，存在兩代 PEG 修飾法，一是借助分子量不足 12kDa 的分子；二是借助分支PEG 替代 PEG，提升偶聯(lián)分子量，同時增加其數(shù)量，使其達到 60kDa。相較于一代，二代方法還能夠避免蛋白質(zhì)被酶水解，同時屏蔽效應更大，同時降低清除率，是延長藥效的有效方法。

       ③血清白蛋白融合：人體中的血清白蛋白，簡稱 HSA，其內(nèi)含 585 氨基酸球形蛋白質(zhì)，分子量為 65kDa，屬于人體中高血漿含量蛋白質(zhì)。HSA 是諸多內(nèi)外源物質(zhì)載體，藥物與 HSA 結(jié)合后，能夠降低生物利用度，并在同一時間增加半衰期。臨床諸多治療蛋白藥物以及多肽藥效均較短，但是 HSA 理論上最長能夠?qū)⑵涮嵘?19d，同時由于 HSA 基因還能夠高效表達，雜質(zhì)少，因此屬于延長藥效的重要方法。

       目前，大量用于治療多種人類疾病的重組蛋白藥物，已獲批準并上市。經(jīng)過幾十年的技術發(fā)展，我國重組蛋白藥物也取得了很大的進步，尤其是近兩年新冠疫 苗的研發(fā)上。隨著分子和細胞技術的不斷發(fā)展，重組蛋白藥物的產(chǎn)量和質(zhì)量也有了很大的提高，加工周期大幅縮短。隨著基因編輯技術的發(fā)展，特別是 CRISPR/Cas9 等新型技術的應用，載體工程取得新的突破，未來越來越多特定改造的細胞系將被用于重組蛋白藥物的生產(chǎn)。此外，進一步提高國內(nèi)重組蛋白藥物的長效性，推動相關標準的升級和創(chuàng)新，促進長效性蛋白藥物的開發(fā)，也是我國生物醫(yī)藥的研究重點。

       參考資料

       [1]周娜娜,王小艷,張媛,王靖,趙國淼,魏超,楊凱,安泰.重組蛋白藥物的生產(chǎn)技術進展[J].生物技術進展,2021,11(06):724-731.DOI:10.19586/j.2095-2341.2021.0130.

       [2]李學琴. 長效重組蛋白藥物的研究進展[J]. 健康之友,2020(14):291,290.

       作者簡介：小泥沙，食品科技工作者，食品科學碩士，現(xiàn)就職于國內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，從事營養(yǎng)食品的開發(fā)與研究。