任哲郯¹，謝雨瑤¹，劉安琪^2*

       心血管疾病 (Cardiovascular Disease，CVD) 是迄今為止世界上的主要死因，每年造成1770萬(wàn)人死亡[1]。而我國心力衰竭發(fā)生率居高不下：25歲以上患病率1.1%，總數超過(guò)1200萬(wàn)，主要病因為高血壓及冠心病[2]。因此心血管疾病的防控仍面臨巨大的挑戰。一系列損害心室血液充盈或流出的結構或功能障礙可導致心力衰竭 (heart failure, HF)[3]。心力衰竭作為具有多種病因及各種因素影響的臨床綜合征，由于缺乏對發(fā)病率、普遍性和預后的可靠的基于人群的估計，一直沒(méi)有辦法做到準確評估HF的程度 [4、5]。斑馬魚(yú)胚胎期的心臟發(fā)育很迅速，心臟功能容易觀(guān)察和量化。對于反向遺傳學(xué)，通過(guò)使用嗎啉反義寡核苷酸和CRISPR-Cas9來(lái)調控基因功能，使斑馬魚(yú)成為體內選擇基因的主要動(dòng)物模型之一[6]。斑馬魚(yú)有很強的心臟再生能力，它們的心肌細胞能夠通過(guò)恢復到不成熟狀態(tài)，然后增殖并替換受損的心臟組織[7]。然而，利用斑馬魚(yú)模型來(lái)增加對心力衰竭和心臟重塑（包括心臟肥大和增生）的了解，卻沒(méi)有得到應有的重視。本文將會(huì )系統回顧藥物誘導斑馬魚(yú)心血管疾病模型的方法，并對其優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行對比，以期為斑馬魚(yú)模型在研究人類(lèi)心血管疾病機制和治療中提供新思路。

       1 斑馬魚(yú)作為人類(lèi)疾病動(dòng)物模型的優(yōu)缺點(diǎn)

       在過(guò)去的研究中，斑馬魚(yú)已經(jīng)成為研究心臟疾病的一個(gè)強大的脊椎動(dòng)物模型。越來(lái)越多地被用來(lái)研究發(fā)育、解剖和生理學(xué)，通過(guò)遺傳學(xué)、藥理學(xué)和其他醫學(xué)實(shí)驗技術(shù)[7]，構建斑馬魚(yú)模型的優(yōu)勢越來(lái)越明顯（表1）。斑馬魚(yú)作為心血管系統疾病的常用模型，也具有許多優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)（表2），即便如此，斑馬魚(yú)的心肌細胞再生能力和電生理特點(diǎn)也使其成為在心肌損傷和心力衰竭治療的重要突破口。

表1 斑馬魚(yú)作為人類(lèi)一般疾病模型的優(yōu)缺點(diǎn)

表2 斑馬魚(yú)作為人類(lèi)心血管疾病模型的優(yōu)缺點(diǎn)

       2 藥物誘導的斑馬魚(yú)心力衰竭模型

       2.1 異丙腎上腺素

       已知β-腎上腺素能受體(β-AR)信號在人類(lèi)HF中失調。在嚙齒類(lèi)動(dòng)物中，異丙腎上腺素 (isoproterenol, ISO, 又名喘息定) 的急性或慢性β-AR激活會(huì )導致心肌損傷,導致心臟功能障礙和心室重構，Grimm等[11]、Heather等[12]、Wang等[13]依據此建立了HF模型。在成年斑馬魚(yú)中，ISO連續給藥14天會(huì )引起類(lèi)似于哺乳動(dòng)物的嚴重收縮性心臟功能障礙，伴隨著(zhù)β-AR成分的轉錄變化、ANP和BNP基因表達的增加、細胞死亡增加、炎癥加劇和心肌細胞對Ca2+處理受損等[14]。然而，與哺乳動(dòng)物模型不同的是，斑馬魚(yú)模型沒(méi)有檢測到心肌細胞的纖維化。在胚胎斑馬魚(yú)中，ISO連續給藥5天誘導收縮性心臟功能障礙以及ANP和BNP基因表達的增加[14]。因此，給予胚胎和成年斑馬魚(yú)ISO刺激對于心臟肥大、心臟重塑和HF的病理生理機制的研究是可行的。

       2.2 去氧腎上腺素

       去氧腎上腺素(phenylephrine, PE, 又名新福林)是選擇性α1 -腎上腺素能受體激活劑。Iaccarino等[15]給予小鼠PE會(huì )增加血壓并通過(guò)增加心室后負荷導致心臟肥大。Romano等[16]用PE處理離體培養成年斑馬魚(yú)心臟會(huì )誘導其肥大。用鬼筆環(huán)肽染色的肌動(dòng)蛋白和胚胎心外膜標記物WT1提示，經(jīng)PE處理的離體成年斑馬魚(yú)心臟可誘導心肌細胞肥大和心外膜增生。這種離體培養成年斑馬魚(yú)心臟肥大模型類(lèi)似于哺乳動(dòng)物模型，因其實(shí)驗條件簡(jiǎn)單，可能在某種程度上為研究心臟肥大提供優(yōu)勢。

       2.3 馬兜鈴酸

       馬兜鈴酸 (aristolochic acid, AA) 是一種常見(jiàn)于馬兜鈴科開(kāi)花植物中的化學(xué)物質(zhì)。AA是一種中草藥成分，已知對多種器官有毒 性[17]。 在胚胎斑馬魚(yú)中,給予AA會(huì )導致心臟肥大和心肌收縮力逐漸減弱。這種病理變化是對動(dòng)物模型及人類(lèi)有嚴重生命危險[18]。取經(jīng)AA處理的胚胎斑馬魚(yú)樣本，進(jìn)行石蠟包埋切片染色，電子顯微鏡鏡檢顯示心內膜丟失、心肌細胞肥大和心臟纖維紊亂[17]。該作者還展示了該模型在藥物發(fā)現方面的潛力，并確定了三種可減弱HF的化合物：絲裂原活化蛋白激酶1(MEK-1)、查耳酮衍生物C25和酚類(lèi)化合物A11[19]。另一項使用相同AA誘導的HF模型的研究表明，使用恩格列凈（一種鈉-葡萄糖協(xié)同轉運蛋白2（SGLT2）抑制劑）,用于治療II型糖尿病和HF，減弱心臟形態(tài)變化，并降低ANP和BNP基因表達以及胚胎斑馬魚(yú)的死亡率[20]。

       2.4 多環(huán)芳烴

       污染導致的多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAH)暴露與心臟病變有關(guān)，例如心臟肥大、心律失常和收縮功能障礙[21]。Hicken等[22]、Incardona等[23]在斑馬魚(yú)中，胚胎發(fā)育過(guò)程中接觸多環(huán)芳烴也具有心臟毒 性，并對心臟發(fā)育產(chǎn)生不利影響。高環(huán)多環(huán)芳烴、苯并(a)芘 (benzoapyrene, BaP) 在高濃度下會(huì )導致心動(dòng)過(guò)緩和心包水腫[23]。Huang等[18]說(shuō)明胚胎斑馬魚(yú)發(fā)育過(guò)程中暴露于低劑量BaP會(huì )導致成年斑馬魚(yú)心臟肥大，表現為心臟重量與體重比增加、心臟中膠原蛋白沉積以及ANP、BNP和原癌基因c-Myc的表達升高。同樣，胚胎斑馬魚(yú)短暫暴露于低濃度原油會(huì )影響后期的心臟功能[22]。

       2.5 鹽酸苯肼

       鹽酸苯肼(phenylhydrazine hydrochloride, PHZ)是一種小分子，Norman等[24]可通過(guò)裂解紅細胞引起貧血。Sun等[25]證明慢性貧血導致成年斑馬魚(yú)的肥大和增生導致心臟肥大。Ernens等[26]給予成年斑馬魚(yú)PHZ 5周后，短軸縮短率降低，心室直徑增加。然而，由于斑馬魚(yú)具有從HF中恢復的巨大能力，因此在停止給予PHZ 3周后，心臟功能恢復到給藥前水平。因此，該模型可用于研究心臟修復機制。

       2.6 維拉帕米

       維拉帕米（又名異搏定）是一種鈣通道阻滯劑，用于治療心律失常、高血壓和心絞痛。過(guò)量服用維拉帕米會(huì )導致人類(lèi)HF。Zhu等[27]開(kāi)發(fā)了一種用于藥物篩選的維拉帕米誘導的胚胎斑馬魚(yú)HF模型。給予維拉帕米可引起胚胎斑馬魚(yú)心包水腫和靜脈淤血，心輸出量和血流速度降低[27]。該模型通過(guò)測試8種人類(lèi)HF藥物的療效進(jìn)行驗證，這些藥物對斑馬魚(yú)HF模型均顯示出顯著(zhù)的治療效果[27]。因此，這種胚胎斑馬魚(yú)HF模型可用于體內藥物篩選。

       2.7 托特羅定

       托特羅定是一種M毒蕈堿受體拮抗劑，Burczyk等[28]已確定其為斑馬魚(yú)胚胎心臟傳導的抑制劑。托特羅定治療會(huì )導致心率減慢、心包水腫和心律失常。此外，它還誘導Tbx18基因的表達，這對于心肌細胞分化為起搏細胞至關(guān)重要。用托特羅定靶向抑制M受體可能會(huì )在人類(lèi)心臟中誘導新的起搏細胞并改善心律失常起到一定作用[28]。因此，該模型可用于研究心臟傳導系統。

       2.8 特非那定

       特非那定是一種常用的H1受體阻斷藥，用于治療過(guò)敏。然而，特非那定治療過(guò)敏是常常伴有發(fā)生心律失常的風(fēng)險。Gu等[29]開(kāi)發(fā)了特非那定誘導胚胎斑馬魚(yú)的擴張性心肌病DCM模型。給予特非那定后，胚胎斑馬魚(yú)表現出循環(huán)血量減少、心率和心肌收縮力降低、房室傳導阻滯、心包水腫和心室體積擴大[29]。此外，心肌細胞發(fā)生凋亡，BNP基因表達增加。這種快速而簡(jiǎn)單的模型可用于非缺血性HF的藥物篩選和毒 性測定。

       2.9 蒽環(huán)類(lèi)藥物

       蒽環(huán)類(lèi)藥物是常用的抗癌藥物，具有嚴重的不良反應，這其中就包括嚴重的心臟毒 性。Han等[30]已經(jīng)在胚胎斑馬魚(yú)中研究了蒽環(huán)類(lèi)藥物對心臟發(fā)育的毒 性，其對心臟的影響與哺乳動(dòng)物模型相似。阿霉素是一種高效的蒽環(huán)類(lèi)化療藥物，Liu等[31]利用阿霉素誘導胚胎斑馬魚(yú)的CM心肌病模型概括了人類(lèi)患者中觀(guān)察到的心肌細胞凋亡和收縮力下降。該模型可用于篩選心臟保護藥物和研究心臟保護機制。

       3 討論

       心功能不全分為兩種類(lèi)型，其一是常見(jiàn)于冠心病和心肌病等引起的心臟 收縮力降低[射血分數降低的心力衰竭 (heart failure with a reduced ejection fraction, HFrEF)]，另一類(lèi)是常見(jiàn)于高血壓伴左室肥厚和肥厚型心肌病等引起的心肌舒張功能異常[射血分數保留的心力衰竭 (heart failure with preserved ejection fraction, HFpEF)][32]。根據流行病學(xué)調查，HFpEF正在成為HF的主要存在形式[33]。HFpEF的病因尚不完全清楚，并且缺少改善預后的藥物。因此，在構建HF動(dòng)物模型時(shí)，盡可能準確地表述不同的心功能不全類(lèi)型非常重要。目前，斑馬魚(yú)HF模型在收縮或舒張功能障礙方面在很大程度上仍然沒(méi)有主要特征。然而，隨著(zhù)超聲動(dòng)態(tài)心動(dòng)圖的發(fā)展和可用性，成年斑馬魚(yú)HF亞型的特征變得越來(lái)越普遍[34-36]。而在成年斑馬魚(yú)超聲動(dòng)態(tài)心動(dòng)圖中，建立一套完整標準化成像條件（麻 醉、水溫等）指南和表征心臟功能的標準等對于HF亞型分型顯得尤為重要。另外，目前胚胎斑馬魚(yú)HF模型在說(shuō)明HF亞型分型中也有一定進(jìn)展[37]。

       隨著(zhù)心臟負荷的逐漸增大，心臟重塑也在緩慢發(fā)展。成人心肌細胞是終末分化細胞，不能隨著(zhù)壓力的增大而數量增加。相反，心肌細胞的體積會(huì )發(fā)生代償性增大（心臟肥大）來(lái)維持足夠的心臟功能滿(mǎn)足機體的需求。隨著(zhù)時(shí)間的推移，這種適應性肥大變得不適應并通過(guò)許多分子信號通路發(fā)展為HF，這其中的機制在很大程度上仍然不清楚[38、39]。目前已知這些導致心臟重塑的機制包括細胞生長(cháng)和增殖調控、基因表達、免疫反應、細胞代謝、線(xiàn)粒體功能、纖維化、細胞內鈣離子處理受損、細胞死亡等[40]。心臟肥大對機體是有益的還是有害的的問(wèn)題目前仍不清楚[41]。與人類(lèi)不同，斑馬魚(yú)的心臟能夠通過(guò)心肌細胞增殖和細胞大小的增大（肥大）來(lái)應對心臟負荷的增大。而且胚胎斑馬魚(yú)心臟中心肌細胞數量和大小的量化相對簡(jiǎn)單。這使得斑馬魚(yú)成為研究代償性與失代償性心臟重塑具體機制的重要模型。

       4 結論

       本文系統回顧了藥物誘導斑馬魚(yú)心血管疾病模型的方法。這對于斑馬魚(yú)作為人源化動(dòng)物模型具有十分重要的意義，斑馬魚(yú)模型目前已用于體內高通量藥物和藥物毒 性的篩選、藥物誘導的心臟毒 性研究，以及作為納米顆粒載體對于機體的毒 性[42、43]。并且，在心電圖中藥物對QT間期的影響也顯示出人和斑馬魚(yú)之間良好的相關(guān)性[44]。在胚胎斑馬魚(yú)HF模型中，用于治療HF的藥物已被證明可以預防急性HF[45]。另外，基于斑馬魚(yú)體積小、繁殖速度快等特點(diǎn)，一些物理構建模型的方法也有待探究。因此，相信在不久的未來(lái)，斑馬魚(yú)模型將會(huì )在各個(gè)領(lǐng)域為人類(lèi)疾病的研究做出巨大貢獻。

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       作者簡(jiǎn)介：@任哲郯，男，中共預備黨員，錦州醫科大學(xué)第一臨床醫學(xué)院2019級臨床醫學(xué)專(zhuān)業(yè)8班班長(cháng)。參與省部級科研項目7項，發(fā)表學(xué)術(shù)論文6篇。立志為祖國醫學(xué)事業(yè)貢獻青春力量。