嵌合抗原受體（CAR）是一類(lèi)工程化的細胞表面受體，一般表達在T細胞上，介導工程化T細胞針對特定靶點(diǎn)腫瘤細胞的殺傷。其中針對CD19（一種B細胞表面標記蛋白）的兩款CAR-T細胞療法Kymriah（諾華）和Yescarta（吉利德）已經(jīng)于2017年獲得了FDA的批準，開(kāi)創(chuàng )了CAR-T細胞療法的元年。
縱觀(guān)CAR-T的發(fā)展史，第一代CAR-T只有CD3ζ鏈（ITAM，Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs）；第二代CAR-T添加了CD28或4-1BB等共刺激結構域（CM1），比如Kymriah和Yescarta；第三代CAR-T同時(shí)添加了CD28和4-1BB等兩個(gè)共刺激結構域（CM1和CM2）；第四代CAR-T在第二代的基礎上添加了共表達的細胞因子，比如IL-12等；第五代CAR-T同樣基于第二代，添加了激活其它信號通路的共刺激結構域，比如IL2-2Rβ胞內結合SAAT3/5的結構域。這一代又一代各種不同的結構設計，賦予了CAR-T細胞療法無(wú)限的生機和未來(lái)（圖1）。
圖1：CAR-T細胞結構設計發(fā)展歷程
上述5代不同設計的CAR-T，雖然都是工程化組合不同信號分子結構域的結構，但仍局限在直接利用原始結構域的范疇內。比如使用CD3ζ鏈信號傳導基序的天然序列（包含3個(gè)ITAM），或者使用CD28、4-1BB的胞內信號傳導結構域的原始序列，對結構域本身并未做任何工程化改造。特別是CAR設計中最重要的CD3ζ結構域，幾乎全都是包含3個(gè)ITAM結構域的胞內全長(cháng)序列。然而近日紀念斯隆-凱特琳癌癥中心的Michel Sadelain及其團隊在Nature Medicine上發(fā)表的一篇重磅研究指出使用CD3ζ鏈中的1個(gè)ITAM結構域的而不是全長(cháng)，可以獲得更強的腫瘤抑制活性，該研究或將開(kāi)啟未來(lái)CAR結構設計的全新思路。
Michel Sadelain及其團隊針對使用CD28-CD3ζ的CAR-T細胞較容易出現T細胞耗竭的現象，提出假設認為這可能是由于CD3ζ包含的3個(gè)ITAM結構域過(guò)度激活T細胞導致的。因此他們基于CD19-CD28-CD3ζ的經(jīng)典CAR-T結構，設計了3種突變型CD3ζ結構域，分別突變失活了1個(gè)或2個(gè)ITAM結構域（圖2）。結果在小鼠腫瘤模型中發(fā)現只有ITAM-1結構域有活性的CAR-T細胞（1XX）體內抗腫瘤活性反而更強，并且具有更長(cháng)的持久力；而保留ITAM-3結構域活性的CAR-T細胞（XX3）抗腫瘤活性最差（圖3）。
圖2：不同CD3ζ突變的CD19-CD28-CD3ζ結構，通過(guò)點(diǎn)突變技術(shù)廢除了ITAM結構域的活性
圖3：小鼠腫瘤模型評價(jià)CAR-T細胞抑制腫瘤細胞的能力
基于上述實(shí)驗結果，研究者懷疑是不是由于ITAM-3結構域本身傳導信號的能力較弱才導致只保留ITAM-3結構域活性的CAR-T細胞效果最差呢？因此他們設計了只含有ITAM-1或ITAM-3的CAR，結果發(fā)現它們都可以產(chǎn)生相當的、比經(jīng)典的CAR-T更強的抑制腫瘤的活性（圖4）。這些結果說(shuō)明在CD19-CD28-CD3ζ結構中，ITAM的數量和所處的位置對CAR-T細胞抑制腫瘤的能力具有重要的影響，越靠近跨膜區的ITAM傳導信號的能力越強。
圖4：截斷CD3ζ的CAR結構設計和小鼠體內腫瘤抑制能力的評價(jià)
在TCR信號傳導中，CD3ζ的激活基序ITAM發(fā)揮著(zhù)關(guān)鍵的作用。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，當TCR-CD3與MHC-peptide結合后，一個(gè)叫做Lck的酪氨酸激酶磷酸化CD3ζ的ITAM結構域，磷酸化的ITAM招募并結合ZAP-70蛋白，招募的ZAP-70同樣被Lck磷酸化并和Lck一起磷酸化其它的蛋白從而傳導T細胞激活信號（圖5）。
圖5：TCR-CD3信號通路主要相關(guān)蛋白
在T細胞的天然激活過(guò)程中，CD3ζ的3個(gè)ITAM都是不可或缺的，但是為什么在CD19-CD28-CD3ζ結構的CAR-T細胞中只有一個(gè)ITAM反而會(huì )產(chǎn)生更強的腫瘤抑制活性呢？ Michel Sadelain等通過(guò)全基因組規模的轉錄圖譜分析發(fā)現經(jīng)典結構的CAR-T細胞更接近效應T細胞，1XX結構的CAR-T細胞更接近于記憶T細胞，而腫瘤抑制活性最差的XX3結構CAR-T細胞更接近于初始T細胞（圖6）。所以在體內，同時(shí)具備一定效應T細胞和記憶T細胞能力的1XX結構CAR-T細胞具有更持久的腫瘤抑制活性也就不奇怪了。
圖6：3種CAR-T細胞表型分析
最后筆者認為，在CD28作為共刺激結構域的CAR設計中，減少I(mǎi)TAM明顯具有更強的優(yōu)勢；然而在基于4-1BB作為共刺激結構域的設計中，減少還是增加ITAM更有效果還需要實(shí)驗驗證。但最終的目標都是找到一個(gè)最合適的T細胞激活程度，過(guò)多或過(guò)少都不能發(fā)揮最強的腫瘤抑制活性，基于該設計的臨床實(shí)驗也在進(jìn)行中，我們期待將來(lái)會(huì )有不錯的數據公布。
參考文獻：
1. Calibration of CAR activation potential directs alternative T cell fates and therapeutic potency.
2. Selected signalling proteins recruited to the T cell receptor-CD3 complex.
3. Teaching an old dog new tricks: next-generation CAR T cells.
筆者簡(jiǎn)介：Harry，分子生物學(xué)方向碩士，腫瘤免疫療法從業(yè)人員，致力于為更好的腫瘤免疫療法貢獻一份力量。
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