雙特異性抗體（bsAbs）是可以結(jié)合同一目標或不同目標上的兩個表位的抗體。它們能夠同時靶向兩個目標，從而實現(xiàn)新的作用機制（例如，雙重抑制信號通路和招募效應細胞）。因此，雙特異性抗體已成為治療癌癥和其他疾病的強大工具。近年來，處于研發(fā)階段的治療性雙特異性抗體數(shù)量顯著增加。

       目前，雙特異性抗體主要通過重組方法生成，并且已經(jīng)開發(fā)出多種不同的形式。根據(jù)其形式，雙特異性抗體可以大致分為兩大類：包含F(xiàn)c區(qū)的IgG樣分子和缺乏Fc區(qū)的較小非IgG樣分子。一般來說，IgG樣雙特異性抗體的生產(chǎn)技術(shù)難度高于無Fc區(qū)的對應物。根據(jù)其結(jié)構(gòu)對稱性，IgG樣雙特異性抗體可以進一步分為兩大亞組：非對稱雙特異性抗體和對稱雙特異性抗體（圖8.1）。每種亞組雙特異性抗體的純化通常都面臨獨特的挑戰(zhàn)。在介紹IgG樣雙特異性抗體純化的一般路線圖之前，將簡要回顧與每種亞組雙特異性抗體相關的常見副產(chǎn)物及其去除方法。

       非對稱雙特異性抗體

       非對稱雙特異性抗體通常源自兩種具有不同結(jié)合特異性的親本抗體，因此包含四條不同的鏈：兩條不同的重鏈（HCs）和兩條不同的輕鏈（LCs）。當這些鏈在生產(chǎn)細胞中共表達時，需要不同抗原特異性的重鏈發(fā)生異二聚體化。此外，針對一種抗原的輕鏈必須與針對相同抗原的相應重鏈配對。然而，如果允許這四條鏈隨機配對，錯誤組裝的物種（例如，同二聚體、含有錯誤配對輕鏈的分子）可能占總質(zhì)量的約90%。因此，已經(jīng)開發(fā)出多種蛋白質(zhì)工程技術(shù)以強制正確的鏈配對。其中，knobs-into-holes（KiH）和CrossMab技術(shù)是應用最廣泛的兩種方法，分別用于克服重鏈同二聚體化和輕鏈錯誤配對的障礙。然而，盡管這些方法設計精巧，但無法完全避免錯誤鏈配對。此外，鏈表達不平衡和次優(yōu)培養(yǎng)條件可能導致其他副產(chǎn)物（例如，半抗體）。以下部分將簡要介紹去除同二聚體和半抗體的方法。

       同二聚體

       一般來說，同二聚體難以去除，因為它們通常表現(xiàn)出與目標雙特異性抗體相似的物理化學特性。有效清除同二聚體需要充分利用每種雙特異性抗體設計的獨特性。有些特殊設計使得同二聚體與異二聚體雙特異性抗體的分離相對較為簡單。由于不同設計的同二聚體表現(xiàn)出不同的特性，其去除方法將分別討論。

       采用knobs-into-holes技術(shù)構(gòu)建的雙特異性抗體

       許多非對稱IgG樣雙特異性抗體采用了knobs-into-holes技術(shù)來促進重鏈異二聚體化（圖8.2A）。然而，盡管這種策略顯著提高了異二聚體的形成，但同二聚體化仍可能在低水平（例如，5%）發(fā)生。特別是，與knob-knob同二聚體相比，hole-hole同二聚體更為常見，其形成受到knob的一定程度阻礙。因此，如果"hole"重鏈表達過量，同二聚體可能成為主要的副產(chǎn)物。

       張等人最近發(fā)現(xiàn)，與knobs-into-holes設計穩(wěn)定的異二聚體相比，hole-hole同二聚體在低pH條件下穩(wěn)定性較低。在低pH條件下，hole-hole同二聚體會發(fā)生構(gòu)象變化，變得更疏水。利用hole-hole同二聚體對低pH的高敏感性以及隨后的構(gòu)象/疏水性變化，可以促進其分離。在最近的一項研究中，我們發(fā)現(xiàn)，當在略低于通常使用的pH值（例如，pH 4.5，而不是pH 5.5）的條件下加載時，Capto MMC ImpRes能夠提高hole-hole同二聚體與knobs-into-holes異二聚體之間的分辨率。此外，通過在洗滌和洗脫緩沖液中加入5%（體積分數(shù)）聚乙二醇（PEG）3350，可以進一步增強分辨率（作者未發(fā)表的工作）。這種方法對于去除采用knobs-into-holes設計的雙特異性抗體中的hole-hole同二聚體副產(chǎn)物應具有普遍價值。

       基于靜電相互作用驅(qū)動異二聚體化的雙特異性抗體

       在CH3界面不同位置引入電荷置換是另一種促進重鏈異二聚體化的替代策略（圖8.2B）。一般來說，將帶有相反電荷的殘基引入互補的CH3區(qū)域。異二聚體化受到吸引性靜電相互作用的青睞，而同二聚體形成則受到排斥性電荷相互作用的阻礙。與knobs-into-holes設計中兩種類型的同二聚體受到的抑制程度不相等不同，在靜電導向的情況下，對兩種同二聚體的抑制效果是均等的。

       在一項研究中，作者發(fā)現(xiàn)，對于具有不同電荷置換的設計，異二聚體水平范圍為87%至100%，表明這是一種促進異二聚體形成的有效方法。對于選定的設計，當兩種重鏈以1:1的比例表達時，通?？梢匀〉米罴呀Y(jié)果。然而，兩種同二聚體仍可能以少量產(chǎn)生，但可以通過陽離子交換（CEX）色譜法有效去除，因為同二聚體和異二聚體通常由于電荷置換而具有相當不同的電荷特性。

       基于WuXiBody平臺的雙特異性抗體

       WuXi Biologics最近開發(fā)了一種新的雙特異性抗體平臺：WuXiBody（圖8.2C）。在一個Fab臂中，恒定區(qū)（CH1/CL）被T細胞受體（TCR）恒定域所取代。此外，通過非天然的鏈間二硫鍵增強了TCR α和β區(qū)域之間的相互作用。這種設計確保了相應的重鏈-輕鏈配對，并且當與knobs-into-holes技術(shù)結(jié)合時，可以大大解決雙特異性抗體構(gòu)建中的鏈錯配問題。

       TCR恒定域具有相對較低的等電點（pI），這一特性可用于促進同二聚體的去除。在基于WuXiBody格式和knobs-into-holes策略設計雙特異性抗體時，最好將TCR域包含在"knob"半抗體中。此外，"hole"半抗體應略微過量表達。這樣，主要副產(chǎn)物將是"hole"半抗體和hole-hole同二聚體。這兩種副產(chǎn)物不含TCR域，因此其pI高于含有低pI TCR域的雙特異性抗體。這種pI差異有助于通過陰離子交換（AEX）色譜法去除hole-hole同二聚體。例如，在適當?shù)臈l件下，低pI雙特異性抗體可結(jié)合到AEX柱上，而高pI的hole-hole同二聚體則不結(jié)合，留在流穿液（FT）中。

       基于pI工程的重鏈雙特異性抗體

       pI工程是促進雙特異性抗體純化的一種有效手段。在此方法中，通過突變改變一條重鏈的pI值，以增加雙特異性抗體與同二聚體副產(chǎn)物之間的pI差異。pI工程可應用于重鏈可變區(qū)或Fc區(qū)（圖8.2D）?；蛘?，可使用具有不同pI的不同亞類（IgG1、IgG2、IgG3和IgG4）的恒定區(qū)作為構(gòu)成雙特異性抗體的兩條重鏈的恒定區(qū)（例如，將一種親本單抗重鏈的恒定區(qū)替換為來自不同亞類的恒定區(qū)，以生成亞類雜交雙特異性抗體）。增加的pI差異極大地有助于通過離子交換（IEX）色譜法純化目標雙特異性抗體。在最近的一項研究中，IEX色譜法使用pH梯度比使用鹽梯度展現(xiàn)出更高的分辨率。作者表明，即使兩種親本抗體之間的pI差異非常?。?.1個pH單位），也可以使用高度線性的pH梯度實現(xiàn)異二聚體與同二聚體之間的適當分離。

       基于蛋白A結(jié)合能力廢除的重鏈雙特異性抗體

       一種類似于pI工程的策略，也可有效簡化同二聚體去除，即修改一條重鏈Fc的蛋白A結(jié)合親和力（圖8.2E）。在這種設計中，一個重鏈Fc結(jié)構(gòu)域的蛋白A結(jié)合能力被廢除（稱為Fc*）。然后，雙特異性抗體和兩個同二聚體將分別包含F(xiàn)cFc和FcFc/FcFc*。由于蛋白A結(jié)合廢除取代，雙特異性抗體（FcFc*）應具有介于FcFc和FcFc同二聚體之間的中間結(jié)合親和力，后兩者分別表現(xiàn)出正常和嚴重降低的結(jié)合親和力。已知人IgG3亞型不與蛋白A結(jié)合，因此源自人IgG3的Fc鏈是一種天然存在的Fc*?；蛘撸赏ㄟ^將野生型Fc CH3結(jié)構(gòu)域中對蛋白A結(jié)合至關重要的殘基替換為IgG3中的相應殘基來生成Fc*。

       由此產(chǎn)生的工程化親和力層次結(jié)構(gòu)有助于使用蛋白A色譜法將所需的雙特異性抗體與同二聚體雜質(zhì)分離。FcFc同二聚體不會結(jié)合，因此出現(xiàn)在流穿液中。雙特異性抗體（Fc*Fc）和FcFc同二聚體都會結(jié)合，但親和力不同：前者結(jié)合得不如后者緊密。弱結(jié)合的雙特異性抗體可以在較不嚴格的pH條件下選擇性洗脫，而在此條件下，緊密結(jié)合的FcFc同二聚體得以保留。通過在洗脫緩沖液中加入CaCl2或MgCl2，可以進一步改善雙特異性抗體與FcFc同二聚體之間的分離。人們認為，通過調(diào)節(jié)抗體與蛋白A配體之間的疏水相互作用，可以實現(xiàn)改善的分辨率。

       通用重鏈雙特異性抗體 - kl體

       采用通用重鏈的雙特異性抗體設計完全避免了重鏈配對問題，雙特異性由兩條不同的輕鏈賦予：一條κ鏈和一條λ鏈（圖8.2F）。在這種設計中，未引入任何突變或外源序列。除了所需的kl體外，當三條鏈（重鏈、κ輕鏈和λ輕鏈）共表達時，還會產(chǎn)生單κ和單λ同二聚體。然而，kl體的獨特性質(zhì)使得這兩種雜質(zhì)（κκ和λλ）能夠通過依次使用KappaSelect和LambdaFabSelect樹脂進行親和純化而易于去除，這兩種樹脂分別結(jié)合κ和λ輕鏈的恒定區(qū)。雖然雙特異性kl體可以結(jié)合這兩種樹脂，但單λ和單κ同二聚體分別在KappaSelect和LambdaFabSelect的柱流穿液中被消除，最終得到純化的kl體。盡管這兩種親和色譜的順序可以互換，但如果一種單特異性物質(zhì)的含量高于另一種（例如，如果單λ多于單κ，則KappaSelect應置于LambdaFabSelect之前），則最好先去除主要的單特異性物質(zhì)，以便為靶kl體節(jié)省大部分柱的載樣容量。

       單鏈可變片段（scFv）-Fc

       單鏈可變片段（scFv）是通過連接重鏈和輕鏈的可變區(qū)構(gòu)建而成的，兩者之間通過連接肽相連。作為一種避免重鏈-輕鏈錯配的策略，一些雙特異性抗體采用了Fab-scFv格式，其中一個Fab臂被scFv所取代。在這種設計中，需要共表達三條鏈（重鏈、輕鏈和scFv-Fc）以組裝雙特異性抗體。在某些情況下，scFv-Fc表達過量，成為主要的雜質(zhì)。由于scFv-Fc包含F(xiàn)c區(qū)，因此無法使用蛋白A親和色譜法將其與目標雙特異性抗體分離。然而，雙特異性抗體和scFv-Fc之間的區(qū)別在于，前者含有輕鏈恒定區(qū)，而后者則沒有。這一區(qū)別有助于使用替代的親和樹脂KappaSelect進行分離，該樹脂特異性結(jié)合κ輕鏈的恒定區(qū)。雖然雙特異性抗體可以通過其Fab臂與KappaSelect結(jié)合，但缺乏輕鏈恒定區(qū)的scFv-Fc則無法結(jié)合。這種方法為去除scFv-Fc單體和同二聚體提供了一種有效手段。值得注意的是，另一種κ輕鏈結(jié)合的親和介質(zhì)ProteinL樹脂，它結(jié)合的是可變區(qū)而不是恒定區(qū)，因此無法區(qū)分scFv-Fc和雙特異性抗體。由于scFv（單體和二聚體）可以通過KappaSelect輕松去除，因此在生產(chǎn)采用Fab-scFv格式的雙特異性抗體時，最好讓scFv的表達量略過量，以盡量減少含有正常Fab臂的同二聚體的形成，因為這些同二聚體可能難以去除。

       半抗體

       半抗體是雙特異性抗體生產(chǎn)中的常見雜質(zhì)。在某些情況下，它是由于有意過量表達無法形成同二聚體的重鏈而產(chǎn)生的。由于半抗體僅含有一個Fc結(jié)構(gòu)域，因此其與蛋白A樹脂的結(jié)合能力弱于含有完整Fc區(qū)的雙特異性抗體。因此，在線性pH梯度洗脫時，半抗體會比雙特異性抗體更早地從蛋白A柱中洗脫出來。通過在流動相中加入鹽類，可以進一步改善半抗體與完整抗體之間的分辨率。根據(jù)線性pH梯度洗脫結(jié)果，可以開發(fā)出一種包含分步pH洗脫和中間pH洗滌的工藝。中間洗滌的pH值需要足夠低，以洗脫半抗體，同時仍能保留結(jié)合在柱上的雙特異性抗體。最佳洗滌pH值取決于裝載密度。當柱子以低密度裝載時應使用相對較低的pH值，而以高密度裝載時應使用較高的pH值，以實現(xiàn)有效的半抗體清除和合理的收率。一般來說，由于這種工藝具有負荷敏感性，因此不夠穩(wěn)健。

       羥基磷灰石（HA）是一種介導陽離子交換和金屬親和相互作用的混合模式樹脂，它也可以在一定程度上分離半抗體和完整的雙特異性抗體。一般來說，在線性鹽梯度洗脫條件下，半抗體會比雙特異性抗體更早地洗脫出來。在一個案例研究中，雙特異性抗體的純度從裝載時的33%提高到洗脫液中的80%。在另一個例子中，雙特異性抗體的純度從77%提高到97%。Gagnon等人先前表明，在梯度起始和梯度結(jié)束緩沖液中加入5%至10%的聚乙二醇（PEG），可以顯著提高HA的分辨率。因此，在存在PEG的情況下，可以預期半抗體和雙特異性抗體之間能夠?qū)崿F(xiàn)更完全的分離。在線性梯度洗脫下的觀察結(jié)果還表明，可以開發(fā)出分步洗脫工藝，并且通過選擇合適的洗滌條件，可以實現(xiàn)半抗體的大量清除。

       除了HA之外，另一種混合模式樹脂Capto MMC在適當?shù)臈l件下也可以很好地清除半抗體。Capto MMC具有陽離子交換和疏水基團。結(jié)合在柱上的蛋白質(zhì)可以通過線性鹽或pH梯度進行洗脫。一般來說，半抗體的結(jié)合能力弱于雙特異性抗體，通常出現(xiàn)在早期洗脫分數(shù)中（作者未發(fā)表的工作）。根據(jù)線性梯度洗脫的結(jié)果，可以引入一個洗滌步驟，在分步洗脫過程中選擇性地去除半抗體。

       最后，如果半抗體的等電點（pI）與雙特異性抗體的pI有顯著差異，那么可以通過離子交換（IEX）色譜法實現(xiàn)這兩種物質(zhì)的分離。

       對稱雙特異性抗體

       對于采用對稱格式的雙特異性抗體，雙特異性通常是通過在輕鏈或重鏈的任一末端融合第二個抗原結(jié)合單元來實現(xiàn)的。由于對稱雙特異性抗體是通過鏈延伸而不是引入不同的鏈來實現(xiàn)雙特異性的，因此通常與非對稱雙特異性抗體相比，產(chǎn)生的副產(chǎn)物數(shù)量較少。然而，對稱格式的雙特異性抗體顯示出顯著增加的聚集傾向。在某些情況下，聚集物含量高達50%。聚集物可能是由于鏈長增加和柔韌性提高導致的分子間結(jié)構(gòu)域交換而形成的。對于對稱雙特異性抗體，聚集物去除成為下游處理的主要任務。以下部分將分別介紹幾種提供良好聚集物清除能力的色譜法。

       蛋白A色譜法

       一般來說，在典型條件下，蛋白A色譜法去除聚集物的效果不如一些替代色譜策略。盡管已知聚集物的結(jié)合能力比單體更強，但它們通常與單體共同洗脫，僅通過調(diào)整洗脫pH值通常不足以實現(xiàn)良好的分離。最近，我們開發(fā)了一種方法，可以顯著提高蛋白A去除聚集物的能力，允許在捕獲步驟中去除大部分聚集物。特別是，我們發(fā)現(xiàn)，在流動相中加入PEG/氯化鈣或PEG/氯化鈉組合可以顯著提高單體與聚集物之間的分辨率。對于用于方法開發(fā)和演示的案例，優(yōu)化后的程序可將聚集物從大于20%降低到大約3%至4%。這種方法減輕了蛋白A后拋光步驟的聚集物去除負擔，并提高了下游工藝的整體穩(wěn)健性。

       疏水相互作用色譜法（HIC） HIC通常用于去除聚集物，并已被證明非常有效。HIC通常以流穿模式運行，用于此目的。聚集物通常比單體更疏水，可以選擇適當?shù)臈l件，使單體流穿，而聚集物結(jié)合。不同供應商提供的HIC樹脂具有不同程度的疏水性。根據(jù)所使用的特定HIC樹脂，需要調(diào)整裝載中的鹽濃度以獲得最佳結(jié)果。例如，在一項研究中發(fā)現(xiàn)，對于相同的裝載，使用中等疏水性的Phenyl 650 M HIC樹脂時需要0.5 M硫酸銨，而使用高疏水性的POROS Benzyl UltraHIC樹脂時只需要50 mM氯化鈉。

       Capto MMC ImpRes和Capto adhere色譜法

       Capto MMC ImpRes是Capto MMC的分辨率改進版本。與Capto MMC相比，Capto MMC ImpRes的珠子大小和配體密度都有所降低，從而提高了單體與聚集物之間的選擇性。根據(jù)供應商的應用說明，在pH 5.0至7.0和氯化鈉濃度0至150 mM之間可以獲得高結(jié)合容量，而在pH 5.0時可實現(xiàn)高純度。在之前的一項研究中，我們發(fā)現(xiàn)，當使用氯化鈉洗脫柱子時，可以獲得良好的聚集物清除效果，但洗脫峰尾部顯著。考慮到結(jié)合涉及疏水相互作用，這并不令人驚訝。通過使用精氨酸洗脫柱子，可以在不犧牲分辨率的情況下改善峰展寬，因為精氨酸可以破壞靜電和疏水相互作用。

       Capto adhere是另一種能夠去除聚集物的混合模式樹脂。其配體含有能夠進行陰離子交換、疏水相互作用和氫鍵的基團。對于聚集物去除，Capto adhere通常以流穿模式運行。根據(jù)供應商的應用說明，聚集物清除受pH值、電導率和裝載量的影響。一般來說，較高的pH值、較高的電導率和/或較低的裝載量可實現(xiàn)更好的聚集物清除效果。如果在流穿模式下無法實現(xiàn)良好的聚集物去除，則可以嘗試結(jié)合-洗脫模式。

       HA色譜法

       HA色譜法以其強大的聚集物去除能力而聞名。例如，一項研究表明，HA可將聚集物水平從超過60%降低到不到0.1%。HA是一種混合模式樹脂，能夠進行磷酸鹽陽離子交換和鈣金屬親和相互作用。這兩種相互作用協(xié)同作用，但其中一種可能在特定蛋白質(zhì)的保留中占主導地位。磷酸鹽廣泛用于洗脫，因為它可以破壞這兩種相互作用。而氯化鈉對金屬親和相互作用的影響則微乎其微。大多數(shù)抗體主要通過陽離子交換相互作用結(jié)合，聚集物的結(jié)合能力比單體更強。一般來說，使用固定磷酸鹽濃度的氯化鈉梯度洗脫比使用磷酸鹽梯度可以獲得更好的分辨率。先前的研究表明，當將PEG加入流動相中時，可以增強蛋白質(zhì)在HA柱上的保留，且增強程度與蛋白質(zhì)大小成正比，這表明PEG優(yōu)先增強聚集物的保留，從而實現(xiàn)單體和聚集物之間更完全的分離。

       陽離子交換（CEX）色譜法

       陽離子交換色譜法廣泛用于抗體純化的拋光步驟。然而，在典型條件下，它對聚集物的分辨率能力有限。盡管聚集物通常比單體蛋白質(zhì)結(jié)合得更緊密，但兩種物質(zhì)之間的分辨率通常較低，尤其是當聚集物為二聚體時（聚集物峰通常出現(xiàn)在單體峰尾部的肩部）。因此，為了實現(xiàn)足夠的聚集物清除，必須犧牲收率。陽離子交換色譜法通常在酸性條件下運行，這與大多數(shù)抗體的等電點相距甚遠。然而，最近的一項研究表明，堿性pH值的陽離子交換色譜法實現(xiàn)了改善的聚集物去除效果。我們在之前的一項研究中使用POROS XS和Capto SP ImpRes在酸性pH值下進行線性鹽梯度洗脫時，發(fā)現(xiàn)單體和聚集物之間的分離效果較差。然而，當在洗滌和洗脫緩沖液中加入5% PEG 3350時，我們觀察到兩種樹脂的分離效果顯著改善。與HA色譜法的情況一樣，PEG增加了蛋白質(zhì)的保留，且這種效果的大小與蛋白質(zhì)大小成正比。在PEG存在的情況下，聚集物結(jié)合得更緊密，主要出現(xiàn)在洗脫液中。

       純化路線圖

       通過總結(jié)前文提供的信息，我們繪制了圖8.3所示的IgG樣雙特異性抗體純化路線圖。對于每種常見的副產(chǎn)物類型，都提供了一條或多條導向其去除的路徑。對于特定類型的副產(chǎn)物，可以依次使用互補的純化路徑，以實現(xiàn)最佳的清除效果。例如，蛋白A和MMC都能去除半抗體，因此將它們結(jié)合起來應該能夠更完全地去除這種副產(chǎn)物。同樣，當?shù)鞍譇與MMC或HA色譜法結(jié)合使用時，可以預期實現(xiàn)更好的聚集物清除效果。

       總結(jié)

       一般來說，IgG樣雙特異性抗體是通過重新組裝來自兩種不同抗體的鏈或在現(xiàn)有抗體上附加一個抗原結(jié)合單元生成的，分別形成非對稱和對稱分子。非對稱雙特異性抗體的構(gòu)建涉及多條不同的鏈，因此這種類型的雙特異性抗體的表達通常會因隨機鏈配對和鏈表達不平衡而伴隨各種副產(chǎn)物。盡管已經(jīng)開發(fā)出幾種策略來促進正確組裝，但無法完全避免副產(chǎn)物的形成。對稱雙特異性抗體的構(gòu)建涉及較少的鏈，但這種類型的雙特異性抗體由于鏈長增加通常會導致穩(wěn)定性降低和聚集水平升高。對于任何格式的雙特異性抗體，相關的雜質(zhì)都給下游純化帶來了相當大的挑戰(zhàn)。特別是，由于副產(chǎn)物的種類和相對含量因個案而異，很難開發(fā)出一種能夠滿足每種個體雙特異性抗體純化需求的平臺方法。通過收集文獻中可用的針對雙特異性抗體特異性雜質(zhì)去除的信息，我們生成了一個路線圖，為雙特異性抗體純化提供了一般性指導。雖然雙特異性抗體相關的副產(chǎn)物最終需要通過純化過程去除，但解決雙特異性抗體獨特的雜質(zhì)問題不應完全依賴于下游工藝。強烈建議在上游階段（即分子設計、細胞系開發(fā)和細胞培養(yǎng)開發(fā)）進行優(yōu)化，以減輕下游的負擔。

       對于非對稱雙特異性抗體，需要選擇一種能夠強制正確鏈配對的適當策略。此外，所選策略可以與一種促進分離的策略相結(jié)合，這為去除仍可能以少量產(chǎn)生的潛在副產(chǎn)物提供了一種有效手段。例如，在一項研究中，通過將knobs-into-holes技術(shù)與pI工程相結(jié)合，實現(xiàn)了高效率的異二聚體化（>90%）以及從同二聚體副產(chǎn)物中直接分離雙特異性抗體。在另一個案例中，Skegro等人通過將促進重鏈異二聚體化的技術(shù)與非對稱蛋白A結(jié)合策略相結(jié)合，實現(xiàn)了90%至95%的異二聚體高收率和穩(wěn)健的同二聚體痕跡去除。對于對稱雙特異性抗體，對附加結(jié)構(gòu)域和連接鏈的優(yōu)化工程對于最小化聚集至關重要。例如，在IgG-scFv的情況下，通過在scFv部分引入VH-VL鏈間二硫鍵來穩(wěn)定scFv部分，并調(diào)整連接scFv與其余分子部分的連接鏈長度，可以顯著減少聚集物的量。

       除了分子設計外，平衡各條鏈的表達對于良好的雙特異性抗體收率至關重要。在某些情況下，鏈表達不協(xié)調(diào)可能導致副產(chǎn)物增加，從而降低正確組裝的雙特異性抗體的百分比。然而，另一方面，一項研究表明，輕鏈的輕微過量表達是有利的，因為它促進了雙特異性抗體的組裝，并避免了3/4抗體（缺少一條輕鏈的抗體）的產(chǎn)生?？赡苄枰⒄{(diào)才能獲得最佳結(jié)果。此外，培養(yǎng)條件也可能對最終的雜質(zhì)特征產(chǎn)生影響。因此，在雙特異性抗體的情況下，需要篩選更多的載體構(gòu)建、質(zhì)粒比例、小池和培養(yǎng)條件，以實現(xiàn)高生產(chǎn)力并降低產(chǎn)品相關雜質(zhì)。

       總之，盡管團隊合作對于生產(chǎn)任何治療性抗體都至關重要，但對于這種復雜性顯著增加的雙特異性抗體來說，尤其如此。在上游工作充分優(yōu)化的情況下，本工作中提供的純化路線圖才能發(fā)揮其最大的作用。