編者按：體內(nèi)CART已然成為研究熱點，就在昨日，8月21日，吉利德公司 (Nasdaq: GILD) 旗下的Kite宣布，以3.5億美元收購Interius BioTherapeutics，Interius是一家開發(fā)體內(nèi) CAR 療法的生物技術(shù)公司。從官網(wǎng)來看，技術(shù)路徑走的是慢病毒路徑。如今體內(nèi)CART主要有兩類技術(shù)流派，目前來看LNP有LNP的問題，慢病毒有慢病毒載體的問題。體內(nèi)CART雖然很熱門。但并不是一個成熟的技術(shù)平臺，仍然有很多需要探索的。同時能否優(yōu)于TCE，或者下一代TCE也是很難說的。今天邀請了一位在體內(nèi)CART研究頗深的專家來討論這個話題。這也是首次Antibody Research公眾號約稿。

       當(dāng)談?wù)揑N VIVO CAR-T的時候，到底在討論什么

       最近組織了好幾場關(guān)于IN VIVO CAR-T領(lǐng)域的閉門會，邀請了相關(guān)領(lǐng)域的研發(fā)者、創(chuàng)始人和投資人等，引起了一些反響，大家都希望我寫寫總結(jié)。我自知天生愚鈍，文筆拙劣，擔(dān)心不能把各專家的真知灼見準(zhǔn)確地表達(dá)出來，一直未動筆。不過最近看到行業(yè)逐漸熱鬧起來，行業(yè)潛在的問題似乎被有意無意的被隱藏起來，覺得還是有必要和大家好好聊聊。今天出第一期，主要聚焦下面3個問題：

       1.為什么IN VIVO CAR-T的熱潮是在當(dāng)下？

       2.如何看待各病毒載體的IN VIVO CAR-T技術(shù)平臺？

       3.未來的技術(shù)演化到底要關(guān)注哪些問題？

       為什么IN VIVO CAR-T的熱潮是在當(dāng)下

       記得2021年CAR-(i)NK正火爆的時候，我在一個會議上問了個問題：2017年FDA就批準(zhǔn)了CAR-T上市，作為同樣重要的免疫細(xì)胞，為什么CAR-(i)NK產(chǎn)業(yè)發(fā)展還在這么早期？到底什么原因?qū)е铝薈AR-(i)NK的發(fā)展進(jìn)度遠(yuǎn)慢于CAR-T呢?現(xiàn)在的這些原因都解決了嗎？后續(xù)基于上面的疑問，我出了幾篇關(guān)于CAR-(i)NK的行業(yè)報告，在這些報告里面，比較準(zhǔn)確的提示出CAR-(i)NK技術(shù)平臺的風(fēng)險與優(yōu)勢、面臨的挑戰(zhàn)、成藥性的困難等，并且對當(dāng)時的某外國明星CAR-(i)NK企業(yè)的巨大風(fēng)險發(fā)出警示，幾個月該公司的數(shù)據(jù)發(fā)布后，股價一泄千里至今還在低谷。

       同樣的邏輯，上述的幾個問題，可以問問當(dāng)下的IN VIVO CAR-T，到底是怎樣的底層邏輯決定了IN VIVO CAR-T現(xiàn)在可以爆發(fā)？可以成藥？可以成為大藥？

       體外自體和異體CAR-T細(xì)胞療法與體內(nèi)CAR-T細(xì)胞療法的概述

       我們知道IN VIVO CAR-T能成藥的關(guān)鍵點是在于載體的成功，一個理想的載體需要能滿足以下幾條：

       ①特異性靶向:在體內(nèi)只有效轉(zhuǎn)染(靜息態(tài))T細(xì)胞,避免非特異性基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和脫靶效應(yīng)。

       ②高效的轉(zhuǎn)染效率:讓體內(nèi)達(dá)到一定數(shù)量的CAR-T細(xì)胞才能獲得潛在治療效果;確保CAR基因在T細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)和功能活性。

       ③較低的免疫原性。

       ④避免載體失活:避免被自身免疫系統(tǒng)和補(bǔ)體系統(tǒng)滅活。

       ⑤生產(chǎn)簡易，成本極低

       所以對于各IN VIVO CAR-T平臺/公司的評估，評估其載體特點及后續(xù)的轉(zhuǎn)染、表達(dá)、安全性等參數(shù)是重中之重。目前主流的載體分為病毒載體和非病毒載體，后續(xù)我將根據(jù)載體及代表公司，做個系列的文章來梳理。今天重點來討論一下病毒載體，特別是慢病毒載體。

       1.病毒載體技術(shù)路徑發(fā)展沿革

       慢病毒載體結(jié)構(gòu)及特點：

       慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科的RNA病毒家族。早期慢病毒載體，由人類免疫缺陷病毒(HIV)改裝而來，隨后，貓免疫缺陷病毒(FIV)、猿類免疫缺陷病毒(SIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、綿羊髓鞘脫落病毒(MVV)等載體相繼研發(fā)。

       慢病毒載體的結(jié)構(gòu)：

       第一代慢病毒載體為雙質(zhì)粒系統(tǒng)，基本保留了HIV的所有組件，包膜通常采用 VSV-G，以增強(qiáng)載體的廣譜感染能力。雖然這種系統(tǒng)實現(xiàn)了基因轉(zhuǎn)送，但由于包含大量HIV 元件，存在生成復(fù)制性慢病毒（RCL）的風(fēng)險，因此逐步被更安全的設(shè)計所取代。

       第二代慢病毒載體為三質(zhì)粒系統(tǒng)，分為包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒和載體質(zhì)粒，第 2代系統(tǒng)去除了所有 HIV 的輔助基因（vif、vpr、vpu、nef），僅保留必要的結(jié)構(gòu)（gag、pol）和調(diào)控（tat、rev）功能基因。盡管同樣采用三質(zhì)粒模式，但由于輔助基因被刪除，RCL 風(fēng)險顯著降低。這一代系統(tǒng)廣泛被實驗室用于研究場景，部分仍依賴 Tat 激活 5′ LTR，從而體現(xiàn)其對 Tat 的依賴性。

       第三代慢病毒載體系統(tǒng)進(jìn)一步強(qiáng)化了安全性，進(jìn)行了多個關(guān)鍵優(yōu)化：

       Tat 基因被完全移除，并采用融合型異源啟動子（如 CMV 或 RSV）替代 5′ LTR，從而去除了對 Tat 的依賴；

       包裝功能分離：將gag/pol 和 rev 放在不同質(zhì)粒內(nèi)，再加上單獨的包膜質(zhì)粒與轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒，共形成四質(zhì)粒系統(tǒng)；

       引入自失活（SIN）設(shè)計：刪除 3′ LTR 中 U3 區(qū)域（即 ΔU3），使得整合后的病毒難以再次啟動轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步降低安全風(fēng)險。該設(shè)計顯著減少了生成 RCL 的可能性，廣泛應(yīng)用于臨床前研究與 CAR-T 等基因治療研發(fā)中，盡管其操作復(fù)雜、產(chǎn)物滴度相對較低。

       第四代慢病毒載體：當(dāng)前對于第四代慢病毒載體并無統(tǒng)一定義，且在研究中應(yīng)用較少。Oxford推出了其TetraVecta?，將其稱為第四代慢病毒載體體系，并且基于其開發(fā)了新型的in vivo CAR-T的體系，將包膜蛋白替換為尼帕病毒包膜，感興趣的同學(xué)可以查閱其近期發(fā)表在Molecular Therapy的論文https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2025.07.006。

       通過上面的慢病毒載體發(fā)展路徑可以得知，優(yōu)化的方向是為了獲得更強(qiáng)的感染能力、宿主廣泛（分裂和非分裂細(xì)胞）、能夠整合進(jìn)宿主DNA且篩選后穩(wěn)定遺傳、表達(dá)潛伏期短、更低的免疫原性、更高的生產(chǎn)滴度、更高的安全性。

       同時，Paul-Ehrlich-Institut分子生物技術(shù)和基因治療研究小組負(fù)責(zé)人Christian Buchholz在20年前就有了早期的靈感?；?005年發(fā)表在Nature Biotechnology雜志上的一項研究（溶瘤病毒麻疹病毒通過引入編碼靶向腫瘤特異性CD38、EGFR和EGFRvIII的單鏈抗體的基因，有效進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，實現(xiàn)了定向的抗腫瘤作用），Buchholz想知道一個類似的策略是否可以幫助慢病毒載體進(jìn)入特定的細(xì)胞類型。與期望相符，他在2008年報告稱，CD20靶向的慢病毒載體優(yōu)先被B細(xì)胞"吸收"；2012年，其研究又證實，CD8靶向載體能夠進(jìn)入T細(xì)胞。但要將慢病毒載體轉(zhuǎn)化為藥物，需要強(qiáng)有力的有效載荷。隨著殺傷B細(xì)胞的CAR-T細(xì)胞療法在2010年首次進(jìn)入臨床，Buchholz看到了機(jī)會。2018年，他發(fā)表最新成果研究顯示，利用慢病毒載體CD8‐LV（特異性靶向人類CD8細(xì)胞）能夠直接在體內(nèi)產(chǎn)生人類 CD19‐CAR T細(xì)胞，并導(dǎo)致CD19 B細(xì)胞清除。

       一些biotech開始嘗試開發(fā)這一策略，并逐漸做出一些調(diào)整，包括細(xì)胞靶向片段的選擇、治療載荷的選擇等。但其中還面臨一些其他的問題需要解決。

       我們知道，慢病毒感染細(xì)胞主要是通過VSV-G/LDL-R通路實現(xiàn)的，LDL-R幾乎在絕大多數(shù)細(xì)胞上都有表達(dá)，這就表明慢病毒具有泛嗜性特征，但是在EX VIVO CAR-T的工藝中，因為感染都得分選富集后的T細(xì)胞，所有慢病毒得泛嗜性特征不會帶來脫靶等風(fēng)險。但在IN VIVO CAR-T平臺中，如果不解決泛嗜性問題，直接回輸慢病毒這個終產(chǎn)品，其安全性風(fēng)險將無疑是巨大的。目前解決慢病毒泛嗜性的通常做法是2類：

       1．是針對VSV-G進(jìn)行基因突變，使其降低/失去和LDL-R結(jié)合的能力，比如EsoBiotec在I331E位點進(jìn)行突變、Interius在I182E/T214N/T352A位點進(jìn)行突變、Kelonia在K47Q/R354A位點進(jìn)行了突變、Vyriad等企業(yè)用的是這個策略。這個策略的好處是依然采用了有大量的數(shù)據(jù)驗證的VSV-G， 但是因為VSV-G蛋白和LDL-R結(jié)合的點位非常有限，所以留給后來者進(jìn)行突變的機(jī)會，其實越來越少，在后續(xù)的產(chǎn)品中，是否會產(chǎn)生專利風(fēng)險，值得關(guān)注。

       2．是篩選新的假型蛋白，比如Umoja采用了Cocal-V-G假型蛋白、Oxford采用的NiV GM△34+F△22體系、易慕峰生物采用了MxV-G假型蛋白并對其突變的策略。這個策略好處是差異化的技術(shù)平臺未來會更有可能得到大的交易機(jī)會，無知識產(chǎn)權(quán)風(fēng)險、更大的改造空間；挑戰(zhàn)在于能否篩到合適的新的假型蛋白，并且找到適合的突變位點，新的新的假型蛋白數(shù)據(jù)少，科學(xué)性上需要更多的驗證。

       相信聊到這樣，就會有人提問了，慢病毒既然失去了與LDL-R結(jié)合的能力，也就失去了感染細(xì)胞的能力，如何實現(xiàn)精準(zhǔn)的靶細(xì)胞感染呢?這里就需要采用增加T細(xì)胞靶向模塊，常用的細(xì)胞靶向模塊的有:

       1.靶向非激活型T細(xì)胞的策略: 主要靶向CD7+T細(xì)胞，比如Interius

       針對非激活型 T細(xì)胞的策略，主要聚焦于識別 CD7 陽性的靜息狀態(tài) T細(xì)胞，例如 Interius BioTherapeutics 所開發(fā)的 INT2104。該療法利用工程化的慢病毒載體，通過靜脈注射直接靶向 CD7?的 T細(xì)胞和 NK細(xì)胞，將 CAR 基因傳遞至目標(biāo)細(xì)胞，在體內(nèi)原位生成 CAR T 和 CAR NK細(xì)胞，實現(xiàn)對 CD20? B 細(xì)胞惡性腫瘤的打擊。值得一提的是，Interius 在 2024 年 7 月已獲得澳大利亞人類研究倫理委員會（HREC）批準(zhǔn)，啟動其首個人體 I 期臨床試驗。感興趣的同學(xué)可以參考其發(fā)表在Molecular Therapy的論文，該論文對其產(chǎn)品設(shè)計有詳細(xì)的描述，鏈接如下：Targeted in vivo delivery of genetic medicines utilizing an engineered lentiviral vector platform results in CAR T and NK cell generation - PubMed。

       靶向激活型的策略:主要靶向CD3+T細(xì)胞，比如Kelonia、EsoBiotec、Umoja等，其次，針對激活型 T 細(xì)胞的策略則主要利用 CD3或TCR等分子為靶點進(jìn)行T細(xì)胞的激活和轉(zhuǎn)導(dǎo)。該領(lǐng)域的BD/收購交易明顯更為活躍。Umoja Biopharma 的 UB-VV111，基于其 VivoVec? 平臺，可識別并通過CD3/CD80/CD58三重信號分子激活T細(xì)胞，在體內(nèi)直接遞送 CAR 基因完成CAR-T 的原位生成。Umoja 成為了目前唯一一家獲得FDA IND 批準(zhǔn)的公司。此外，此領(lǐng)域中另一個亮眼案例是 EsoBiotec 最近在《柳葉刀》（The Lancet）上發(fā)表了其 in vivo CAR-T 候選藥 ESO-T01 的臨床早期數(shù)據(jù)。該研究報道首批接受該療法的四位多發(fā)性骨髓瘤患者中，有兩位達(dá)到了嚴(yán)格完全緩解（sCR），其他兩位取得了部分緩解，并且骨髓檢測在第 28 天即顯示微小殘留?。∕RD）陰性。這些病人接受的劑量僅為2×10^8 TU，卻展現(xiàn)了顯著的療效，顯示出 EsoBiotec 的ENaBL 平臺的巨大潛力。不過需要指出的是，該臨床試驗也顯示出與傳統(tǒng)CAR-T療法不一樣不良反應(yīng)譜，且更為快速和嚴(yán)重，其產(chǎn)品或臨床方案仍需持續(xù)優(yōu)化。感興趣的同學(xué)可以參考其發(fā)表在柳葉刀的論文，鏈接如下：In-vivo B-cell maturation antigen CAR T-cell therapy for relapsed or refractory multiple myeloma - PubMed。

       對于T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，特別是靜息態(tài)T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與激活能力，是IN VIVO CAR-T取得療效的重要基礎(chǔ)，未來病毒載體公司的療效差異可能很大一部分原因就是來自于該模塊。所以對于該指標(biāo)更要認(rèn)真、全面的評估和審查。

       病毒作為外來物，回輸體內(nèi)以后，會被機(jī)體的先天免疫系統(tǒng)和補(bǔ)體系統(tǒng)識別和吞噬等，這樣對于最終的療效會帶來巨大的影響，為此各個公司也都做了不同的"盾牌"設(shè)計和優(yōu)化，比如Esobiothec,對MHC-I進(jìn)行了敲除和增加了CD47的過表達(dá)。這樣的盾牌涉及對于產(chǎn)品的穩(wěn)定表達(dá)到底帶來怎么的效果，任需要持久的觀察。

       暢想未來，IN VIVO帶來巨大的想象力，同時也必須要清醒的認(rèn)識到，這個平臺剛剛起步，仍有很多問題需要回答，比如：

•        各載體轉(zhuǎn)染哪些細(xì)胞才能實現(xiàn)與EX-VIVO細(xì)胞產(chǎn)品相當(dāng)?shù)闹委?

•        持續(xù)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)對于臨床療效是否必要？，特別是對于腫瘤學(xué)或者非腫瘤學(xué)的應(yīng)用?

•        不同組織和細(xì)胞類型中脫靶CAR表達(dá)的后果(毒性/病理學(xué))是什么?

•        不同載體的先天免疫原性如何影響干細(xì)胞活性、抗原呈遞細(xì)胞激活并調(diào)節(jié)連續(xù)給藥方案中的反應(yīng)原性？

•        EX-VIVO細(xì)胞設(shè)計的CAR結(jié)構(gòu)域是否是IN VIVO細(xì)胞治療的最佳選擇?

•        什么給藥途徑可以最大限度地提高所需細(xì)胞類型中的CAR 表達(dá)并最大限度地減少脫靶表達(dá)或先天免疫激活？

•        想要轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)染哪些細(xì)胞類型?使用具有多種免疫譜系趨向性的配體靶問是否可以增強(qiáng)治療效果?且不同的靶向分子對副作用和療效的影響是什么?

•        IN VIVO細(xì)胞療法是否可以更好地動員內(nèi)激性免疫細(xì)胞類型來引發(fā)廣泛的適應(yīng)性抗腫瘤免疫反應(yīng)?

•        IN VIVO 細(xì)胞療法帶來新的毒性譜是否有臨床處理預(yù)案？

       《百年孤獨》里說："世界新生伊始，許多事物還沒有名字，提到的時候尚需要指指點點"，IN VIVO似乎正式這樣的狀態(tài)和階段。所以，相信相信的力量，一起靜待IN VIVO平臺的崛起。

       引用：醫(yī)藥魔方、Nature reviews、Expert Opin Biol Ther. 2013 Jul;13(7):987-1011. doi:10.1517/14712598.2013.779249.