摘要：在生物制藥產業(yè)快速發(fā)展的今天，重組治療性蛋白（如抗體）的高效生產成為關鍵。哺乳動物細胞因能模擬人類細胞的翻譯后修飾（如糖基化），成為生產這類蛋白的核心 "細胞工廠"，其中中國倉鼠卵巢（CHO）細胞和人胚腎 293（HEK293）細胞應用最廣。與需要長期篩選的穩(wěn)定基因表達（SGE）系統(tǒng)不同，瞬時基因表達（TGE）系統(tǒng)憑借 "短周期、易操作" 的優(yōu)勢，成為生物藥早期研發(fā)的重要工具。本文系統(tǒng)梳理了 TGE 系統(tǒng)的組成，詳解了細胞系改造、表達載體工程、培養(yǎng)基優(yōu)化、轉染條件篩選、輔助基因共表達等關鍵優(yōu)化策略，結合最新研究數(shù)據(jù)說明如何提升重組蛋白的產量與質量，為產業(yè)界提供從實驗室到規(guī)?；a的實用參考。

       一、引言：生物制藥的 "細胞工廠" 與瞬時表達的獨特價值

       全球生物制藥市場規(guī)模正以驚人速度擴張，預計 2024 年將達到 3.89 億美元，其中重組治療性蛋白是核心組成部分。這類蛋白的生產依賴于合適的表達系統(tǒng)，細菌、酵母、植物雖各有應用，但哺乳動物細胞因能進行復雜的翻譯后修飾（PTMs）-- 尤其是與人類細胞相似的糖基化，成為生產抗體等復雜蛋白的首選。

       在眾多哺乳動物細胞中，CHO 細胞堪稱 "王牌選手"：全球 89% 的哺乳動物細胞來源生物藥由它生產。這得益于它能合成復雜結構蛋白、可大規(guī)模培養(yǎng)且不易受病毒感染的特性。HEK293 細胞則以 "生長快、轉染效率高" 著稱，在懸浮無血清培養(yǎng)中表現(xiàn)優(yōu)異，常被用于藥物發(fā)現(xiàn)和毒性測試。

       哺乳動物細胞的表達系統(tǒng)分為兩類：穩(wěn)定基因表達（SGE）和瞬時基因表達（TGE）。SGE 需要篩選穩(wěn)定整合目的基因的細胞株，周期長達數(shù)月；而 TGE 無需復雜篩選，直接將目的基因（GOI）導入細胞，2-4 周就能實現(xiàn)從基因克隆到蛋白表達（產量從毫克到克級），尤其適合早期研發(fā)和快速驗證（圖 1）。不過，TGE 的產量目前仍低于 SGE，如何突破這一瓶頸，正是本文要探討的核心。

       二、瞬時基因表達（TGE）系統(tǒng)的核心組成

       TGE 系統(tǒng)的高效運行，依賴于 "細胞系、表達載體、培養(yǎng)基" 三大核心要素的協(xié)同作用。

       （一）細胞系：生產蛋白的 "種子"

       目前 TGE 系統(tǒng)中最常用的是 CHO 和 HEK293 細胞，它們各自衍生出多個亞型，適配不同的生產需求：

       CHO 細胞：源自中國倉鼠卵巢組織，已開發(fā)出 CHO-S、CHO DG44、GS 敲除 CHO 等亞型。其中 CHO-S 生長快速，適合懸浮培養(yǎng)；GS 敲除型通過谷氨酰胺合成酶篩選，能穩(wěn)定表達目的蛋白。

       HEK293 細胞：源自人胚腎細胞，亞型包括 293E、293T、293F 等。293F 在無血清懸浮培養(yǎng)中可達到高細胞密度，轉染效率高，是 TGE 的 "?？?quot;。

       不過，HEK293 細胞也有局限：生產的蛋白糖基化結構與人類細胞存在差異，且易受人類病毒污染，限制了其臨床應用。

       （二）表達載體：攜帶目的基因的 "運輸車"

       表達載體是攜帶目的基因進入細胞的 "工具"，其核心是調控元件，包括啟動子、增強子、終止子等，直接影響蛋白表達效率。例如：

       啟動子：像 "開關" 一樣啟動基因轉錄，人類巨細胞病毒（hCMV）啟動子是常用的 "強開關"，能高效驅動抗體等蛋白的表達。

       輔助蛋白元件：若載體攜帶 EB 病毒核抗原 1（EBNA-1）或大 T 抗原基因，可幫助目的基因在細胞內穩(wěn)定存在，提升 TGE 效率。

       （三）培養(yǎng)基：細胞生長的 "營養(yǎng)餐"

       培養(yǎng)基為細胞提供營養(yǎng)，其成分直接影響細胞活力和蛋白產量。早期培養(yǎng)基需添加 10%-20% 血清，但血清成分復雜、易污染，給下游純化帶來麻煩。如今，無血清培養(yǎng)基（SFM）成為主流：它用明確成分的血清替代物組成，不僅消除了血清干擾，還降低了生產成本，是規(guī)模化生產的 "標配"。

       三、TGE 系統(tǒng)的優(yōu)化策略：從細節(jié)突破產量瓶頸

       要提升 TGE 的效率，需從細胞、載體、培養(yǎng)條件等多維度優(yōu)化。以下是經過實驗驗證的關鍵策略（圖 2）。

       （一）細胞系改造：讓 "細胞工廠" 更高效

       通過基因編輯或工程化改造細胞，可增強其抗凋亡能力、提升蛋白合成效率。

       敲除凋亡基因：細胞在培養(yǎng)中會因壓力凋亡，影響蛋白產量。研究發(fā)現(xiàn)，敲除 CHO-K1 細胞的凋亡基因 Bax 和 Bak 后，抗體滴度提升了 3-4 倍；過表達抗凋亡基因 Bcl-xL，CHO-DG44 細胞的融合蛋白產量增加 70%-270%，且細胞活力能維持在 90% 以上。

       增強蛋白折疊能力：蛋白在細胞內折疊錯誤會導致產量下降。若讓 CHO 細胞過表達未折疊蛋白反應因子（如 XBP-1S）或內質網氧化還原酶（ERO1-La），可幫助蛋白正確折疊，抗體產量能提升 5.3-6.2 倍。

       亞型篩選：ExpiCHO-S?和 Expi293F 等工程化亞型表現(xiàn)突出。Expi293F 在懸浮培養(yǎng)中能達到高細胞密度，轉染后蛋白表達量比普通 293 細胞高 3-4 倍，尤其適合需要復雜修飾的蛋白生產。

       （二）表達載體工程：讓 "運輸車" 更能裝

       優(yōu)化載體的調控元件，可顯著提升目的基因的轉錄和翻譯效率。

       啟動子優(yōu)化：雙啟動子載體（如同時攜帶兩個 hCMV 啟動子）比傳統(tǒng)單啟動子或雙順反子載體更高效，在 CHO 細胞中抗體產量提升 1.4-1.9 倍。此外，cumate 基因開關啟動子（CR5）的效率是 hCMV 啟動子的 3-4 倍，堪稱 "超強開關"。

       順式作用元件：這些元件像 "助推器" 一樣增強基因表達。例如，泛染色質開放元件（UCOE）能防止基因被沉默，使抗體產量提升 1.5 倍；將 WPRE（ woodchuck 肝炎病毒轉錄后調控元件）與內含子 A 等元件組合，可使蛋白表達量提升 10.5 倍。

       信號肽優(yōu)化：信號肽負責引導蛋白分泌到細胞外，選對信號肽能提升分泌效率。人類白蛋白和天青殺素來源的信號肽表現(xiàn)最佳，在 CHO 細胞中可使蛋白產量提升 1.5-2 倍；甚至可通過計算機設計 "定制信號肽"，例如針對難表達的單抗，定制信號肽能使產量提升 2.5 倍。

       （三）培養(yǎng)基與培養(yǎng)工藝：為細胞 "量身定制" 生長環(huán)境

       培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件的細微調整，能大幅提升細胞活力和蛋白產量。

       培養(yǎng)基添加物：

•        蛋白胨（含肽和氨基酸）是 "營養(yǎng)強化劑"，在 CHO-DG44 細胞中添加后，TGE 產量提升 37%；小麥蛋白胨可使細胞生長增加 30%，干擾素 -γ 產量提升 60%。

•        二甲基亞砜（DMSO）和醋酸鋰（LiAc）能幫助蛋白折疊，減少聚集。在 CHO 細胞中添加后，抗體產量可達 80mg/L；HEK293 細胞在轉染后 4 小時添加 10% DMSO，蛋白表達量提升 1.6 倍，且無明顯毒性。

       培養(yǎng)工藝優(yōu)化：

•        溫和低溫培養(yǎng)：細胞在 37℃快速生長后，轉至 32-33℃培養(yǎng)，可使蛋白產量提升 1.5-6.2 倍。這是因為低溫能讓細胞停留在 G1/G0 期，減少分裂能耗，專注于蛋白合成，同時還能增強內質網的蛋白折疊能力。

•        光照調控：通過 CRISPR-dCas9 光控系統(tǒng)（LACE），可在光照下激活基因表達，使 eGFP（綠色熒光蛋白）的 TGE 產量提升 4 倍，實現(xiàn) "按需生產"。

       （四）轉染條件優(yōu)化：讓目的基因 "精準進入" 細胞

       轉染是將目的基因導入細胞的關鍵步驟，優(yōu)化試劑、比例和操作能提升效率。

       轉染試劑選擇：聚乙烯亞胺（PEI）是常用試劑，25kDa 線性 PEI 能使 CHO 細胞的抗體產量提升 2 倍；超支化聚賴氨酸（HBPL）無需預孵育，在含血清培養(yǎng)基中也能高效轉染，產量媲美甚至超過 PEI。

       試劑比例：PEI 與 DNA 的比例（w/w）為 3:1 時，轉染效率最高（60%-66.93%）；在 Bax/Bak 雙敲除 CHO 細胞中，當比例為 5:1 時，抗體產量提升 3-4 倍。

       輔助方法：電穿孔結合抑制劑處理（如丁酸鈉），可使 CHO 細胞的熒光強度提升 4.8 倍；質粒 DNA 經 72℃加熱 30 分鐘，能提升 HEK293T 細胞的轉染效率，可能與去除雜質有關。

       （五）輔助基因共表達：為蛋白生產 "搭把手"

       共表達某些輔助基因，可增強細胞活力、促進目的基因表達或蛋白折疊。

       抗凋亡與增殖基因：共表達 Bcl-xL 能減少細胞凋亡，使 CHO 細胞的蛋白產量提升約 2 倍；EBNA-1 與多瘤病毒大 T 抗原（PyLT）共表達，可使 CHO 細胞的特異性生產力（qP）提升 22.9 倍，因為它們能幫助目的基因在細胞內穩(wěn)定存在。

       microRNA（miRNA）調控：miR-17 和 miR-92a 能促進 CHO 細胞生長，使蛋白產量提升 3 倍；抑制 miR-7 則能減少細胞凋亡，讓分泌型堿性磷酸酶（SEAP）的產量翻倍。

       蛋白折疊輔助因子：共表達親環(huán)蛋白 B（CypB）與 SP35Fc 融合蛋白（比例 5:1），可消除蛋白聚集，使產量提升 6 倍，且產物更純凈。

       四、優(yōu)化效果匯總：數(shù)據(jù)見證突破

       不同優(yōu)化策略的效果可通過細胞密度、產量和特異性生產力（qP）直觀體現(xiàn)（表 1）。例如，細胞系改造中，ExpiCHO-S?能使產量提升 2.5-6 倍；載體工程中，CR5 啟動子的效率是 hCMV 的 3-4 倍；培養(yǎng)基優(yōu)化中，小麥蛋白胨使 CHO-K1 細胞的產量提升 1.6 倍；輔助基因共表達中，EBNA-1 與 NDPK-A 組合能使產量提升 1.75-2.5 倍。這些數(shù)據(jù)證明，多策略聯(lián)合使用（如細胞改造 + 低溫培養(yǎng) + 輔助基因共表達）能實現(xiàn) "1+1>2" 的效果。

       五、總結與展望

       TGE 系統(tǒng)憑借短周期、易操作的優(yōu)勢，已成為生物藥早期研發(fā)的核心工具。通過細胞系改造、載體工程、培養(yǎng)基優(yōu)化等策略，其蛋白產量和質量已大幅提升，但仍面臨批間差異、規(guī)?；a效率不足等挑戰(zhàn)。

       未來，結合組學技術（基因組、轉錄組）和人工智能數(shù)據(jù)分析，有望精準找到影響 TGE 的關鍵因素，設計出 "量身定制" 的優(yōu)化方案。例如，通過 AI 預測最佳培養(yǎng)基成分或轉染條件，進一步縮短研發(fā)周期、降低成本?？梢灶A見，隨著技術的突破，TGE 系統(tǒng)將在生物制藥產業(yè)中發(fā)揮更大作用，加速更多創(chuàng)新藥從實驗室走向臨床。