摘要：高濃度蛋白質(zhì)溶液在生物制藥中應(yīng)用廣泛，其制備方法通常在早期研發(fā)階段采用旋轉(zhuǎn)柱濃縮（SCC），后期采用切向流過(guò)濾（TFF） 。本研究以一種 Fc 融合蛋白為例，發(fā)現(xiàn)兩種方法制備的高濃度溶液在儲(chǔ)存穩(wěn)定性上存在差異 。TFF 處理的樣品在儲(chǔ)存時(shí)聚集和粘度增加更明顯，這是由于 TFF 過(guò)程中在中間不穩(wěn)定緩沖條件下的剪切作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象改變 。因此，早期研發(fā)階段測(cè)試 TFF 過(guò)程中過(guò)渡緩沖狀態(tài)下的剪切應(yīng)力敏感性，對(duì)降低產(chǎn)品不穩(wěn)定風(fēng)險(xiǎn)十分重要 。
一、高濃度蛋白質(zhì)溶液的制備與穩(wěn)定性問(wèn)題
在生物制藥領(lǐng)域，為滿足患者需求并降低成本，高濃度蛋白質(zhì)制劑備受青睞，尤其是用于皮下注射的高劑量蛋白質(zhì)治療藥物 。不過(guò)，開發(fā)這類制劑面臨諸多挑戰(zhàn)，其中溶液粘度增加和蛋白質(zhì)聚集傾向是較為突出的問(wèn)題 。在藥物研發(fā)過(guò)程中，早期由于蛋白質(zhì)樣品量有限，常采用 SCC 方法進(jìn)行緩沖液交換和濃縮；后期隨著蛋白質(zhì)產(chǎn)量增加，則會(huì)使用 TFF 方法 。通常認(rèn)為這兩種方法制備的蛋白質(zhì)性質(zhì)相似，但本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于一種 Fc 融合蛋白，SCC 和 TFF 制備的高濃度溶液在儲(chǔ)存穩(wěn)定性上存在顯著差異 。這種差異表明，緩沖液交換路徑可能對(duì)蛋白質(zhì)的儲(chǔ)存穩(wěn)定性和粘度產(chǎn)生重要影響 。
二、實(shí)驗(yàn)方法
蛋白質(zhì)的制備與處理：首先通過(guò)模型細(xì)胞系生產(chǎn) Fc 融合蛋白，經(jīng) Protein A 捕獲和離子交換色譜法純化后得到未配方的 bulk drug substance（UFBDS） 。對(duì)部分 UFBDS 添加聚山梨酯 80（PS80）得到配方的 bulk drug substance（FBDS） 。然后分別用 SCC 和 TFF 兩種方法將蛋白質(zhì)溶液濃縮至目標(biāo)濃度 。SCC 是利用離心過(guò)濾裝置將 UFBDS 濃縮，TFF 則是使用特定的膜系統(tǒng)在一定壓力和通量條件下進(jìn)行緩沖液交換和濃縮（可簡(jiǎn)單繪制 SCC 和 TFF 過(guò)程的示意圖，幫助讀者理解兩種方法的操作流程） 。
分析方法：運(yùn)用多種分析技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè) 。采用尺寸排阻色譜（SEC）監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)聚集情況，通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射（DLS）測(cè)量流體力學(xué)半徑，用非還原毛細(xì)管電泳 - 十二烷基硫酸鈉（CE - SDS）分析大小變體，使用 Malvern Viscosizer™ 200 測(cè)定粘度，利用差示掃描量熱法（DSC）和差示掃描熒光法（DSF）研究蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性和構(gòu)象變化 。此外，還通過(guò)組合篩選實(shí)驗(yàn)，研究不同緩沖條件和剪切應(yīng)力對(duì)蛋白質(zhì)聚集的影響 。
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
儲(chǔ)存穩(wěn)定性差異：在不同溫度（5°C、25°C 和 40°C）下儲(chǔ)存 3 個(gè)月后，TFF 處理的樣品在聚集、流體力學(xué)半徑、大小變體和粘度等方面均表現(xiàn)出比 SCC 處理樣品更明顯的變化 。例如，在 25°C 和 40°C 儲(chǔ)存時(shí)，TFF 樣品的聚集程度（以 % HMWS 表示）更高（原文 Fig. 1，直觀展示 TFF 和 SCC 樣品在加速儲(chǔ)存條件下的聚集情況差異）；40°C 儲(chǔ)存 3 個(gè)月后，TFF 樣品的流體力學(xué)半徑更大（原文 Fig. 2，呈現(xiàn)不同處理樣品在不同儲(chǔ)存溫度下的流體力學(xué)半徑變化）；在 CE - SDS 分析中，40°C 儲(chǔ)存時(shí) TFF 樣品的降解片段濃度更高（原文 Fig. 3，展示 TFF 和 SCC 樣品在 40°C 儲(chǔ)存 3 個(gè)月后的大小變體差異）；而且 TFF 樣品的粘度在儲(chǔ)存后顯著增加，而 SCC 樣品的粘度幾乎不變（原文 Fig. 4，對(duì)比 TFF 和 SCC 樣品在不同儲(chǔ)存溫度下的粘度變化） 。
材料特性差異：盡管兩種方法制備的蛋白質(zhì)溶液在生產(chǎn)后立即進(jìn)行的常規(guī)釋放檢測(cè)中表現(xiàn)相似，但 DSF 分析顯示，TFF 處理的蛋白質(zhì)在較低溫度下就開始與熒光染料發(fā)生相互作用，表明其三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，疏水性表面暴露更多，相比 SCC 處理的蛋白質(zhì)更不穩(wěn)定 。而 DSC 數(shù)據(jù)未顯示出兩者的差異（原文 Fig. 5 和 Fig. 6，對(duì)比 DSC 和 DSF 對(duì) TFF 和 SCC 處理材料的分析結(jié)果） 。
緩沖條件和剪切應(yīng)力的影響：實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在從一種緩沖液轉(zhuǎn)換到另一種緩沖液的過(guò)程中，特別是在 0.5 - 1.5 倍透析體積的中間緩沖條件下，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性較差。當(dāng)樣品處于這種中間緩沖條件并受到剪切應(yīng)力時(shí)，蛋白質(zhì)損失和聚集現(xiàn)象更為嚴(yán)重（原文 Fig. 7，展示不同緩沖條件和剪切應(yīng)力組合下蛋白質(zhì)的損失情況）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)較低濃度的蛋白質(zhì)樣品施加不同程度的剪切應(yīng)力，并在 35°C 儲(chǔ)存后，樣品的聚集程度與剪切暴露相關(guān)，且蛋白質(zhì)構(gòu)象也發(fā)生了變化，這通過(guò) FTIR 光譜分析得到了證實(shí)（原文 Fig. 8，呈現(xiàn)剪切應(yīng)力和儲(chǔ)存溫度對(duì)蛋白質(zhì)聚集和構(gòu)象的影響）。
四、結(jié)果討論
兩種制備方法的差異：在藥物研發(fā)早期，SCC 常被用作 TFF 的替代方法，但本研究表明二者存在差異 。TFF 處理的蛋白質(zhì)在儲(chǔ)存時(shí)更易聚集，粘度也更高，這可能是因?yàn)?TFF 過(guò)程中蛋白質(zhì)在中間不穩(wěn)定緩沖條件下受到剪切，導(dǎo)致構(gòu)象發(fā)生變化 。雖然 DSC 顯示兩種方法處理的蛋白質(zhì)解折疊溫度相似，但 DSF 結(jié)果表明 TFF 處理的蛋白質(zhì)在較低溫度下就會(huì)暴露更多疏水區(qū)域，說(shuō)明其構(gòu)象穩(wěn)定性較差 。
緩沖條件和剪切應(yīng)力的作用：蛋白質(zhì)的構(gòu)象由非共價(jià)力維持，在 TFF 過(guò)程中，隨著蛋白質(zhì)濃度增加，溶液粘度和維持通量所需的壓力也會(huì)增加，再加上透析過(guò)程中復(fù)雜的緩沖環(huán)境，容易破壞蛋白質(zhì)的構(gòu)象穩(wěn)定性 。從純化緩沖液到配方緩沖液的交換過(guò)程中，中間緩沖狀態(tài)可能使蛋白質(zhì)形成部分解折疊的中間體，若這些中間體保留在最終產(chǎn)品中，會(huì)影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性 。此外，剪切應(yīng)力本身雖不一定會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)顯著聚集或降解，但在不穩(wěn)定的緩沖環(huán)境下，會(huì)加劇蛋白質(zhì)的聚集 。
對(duì)藥物研發(fā)的啟示：了解蛋白質(zhì)對(duì)緩沖條件和剪切應(yīng)力的敏感性，對(duì)開發(fā)穩(wěn)定的藥物制劑至關(guān)重要 。早期研究中使用 SCC 方法可能無(wú)法發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)對(duì)特定緩沖環(huán)境的不穩(wěn)定性，而在后期 TFF 過(guò)程中這種問(wèn)題可能會(huì)顯現(xiàn)出來(lái) 。因此，在早期研發(fā)階段就應(yīng)測(cè)試蛋白質(zhì)在 TFF 過(guò)程中過(guò)渡緩沖狀態(tài)下的剪切應(yīng)力敏感性，以避免在藥物開發(fā)后期出現(xiàn)意外問(wèn)題 。
五、研究結(jié)論
本研究通過(guò)對(duì) Fc 融合蛋白的研究發(fā)現(xiàn)，TFF 和 SCC 制備的高濃度蛋白質(zhì)溶液在儲(chǔ)存穩(wěn)定性上存在差異，TFF 過(guò)程中在中間不穩(wěn)定緩沖條件下的剪切作用會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，進(jìn)而使 TFF 處理的材料在儲(chǔ)存時(shí)聚集速率和粘度更高 。對(duì)于對(duì)緩沖條件敏感的蛋白質(zhì)，早期研究其在剪切應(yīng)力下對(duì)緩沖液交換環(huán)境的敏感性，有助于開發(fā)更穩(wěn)健的配方和工藝，避免藥物開發(fā)后期出現(xiàn)產(chǎn)品穩(wěn)定性問(wèn)題 。
合作咨詢
肖女士
021-33392297
Kelly.Xiao@imsinoexpo.com
2006-2025 上海博華國(guó)際展覽有限公司版權(quán)所有（保留一切權(quán)利）
滬ICP備05034851號(hào)-57
