在基因和細胞治療領(lǐng)域，基因替代療法已廣泛應用于臨床。然而，如何在疾病治療過程中實現(xiàn)外源基因時空特異性地反復可逆的表達調(diào)控仍面臨挑戰(zhàn)。相較于 DNA 編輯技術(shù)造成基因序列的永久改變，RNA 編輯則可通過動態(tài)可逆的方式調(diào)控蛋白質(zhì)表達，這一獨特優(yōu)勢使其成為極具潛力的基因治療策略。目前，基于 RNA 水平的可調(diào)控基因表達系統(tǒng)主要包括以下幾類：適配體依賴的核酸開關(guān)、小分子誘導的可變剪接系統(tǒng)以及 RNA 結(jié)合蛋白響應開關(guān)等。這些系統(tǒng)通過調(diào)控 mRNA 的穩(wěn)定性、剪接過程或翻譯效率來實現(xiàn)基因表達的可控調(diào)節(jié)。然而，現(xiàn)有技術(shù)主要局限于外源基因的調(diào)控，在內(nèi)源基因的精確控制方面仍存在局限性。
RNA 堿基編輯系統(tǒng)能夠在內(nèi)源和外源 RNA 中執(zhí)行精準的堿基轉(zhuǎn)換從而實現(xiàn)特定基因功能的激活或者失活。腺苷 RNA 堿基編輯器因其編輯效率高，在疾病治療中極具潛力。它以腺苷脫氨酶（ADAR）為核心催化酶，將雙鏈 RNA 底物中的腺苷（A）轉(zhuǎn)換為肌苷（I），由于肌苷與鳥苷（G）的結(jié)構(gòu)相似，在蛋白質(zhì)翻譯過程中它能夠與胞苷（C）配對，從而實現(xiàn) A-to-G 的堿基轉(zhuǎn)換效果。根據(jù)編輯器中 ADAR 的來源，RNA 腺苷堿基編輯器可分為兩大類：第一類通過招募內(nèi)源 ADAR 到靶點附近實現(xiàn) A-to-I 編輯，例如 LEAPER 系統(tǒng)。第二類過表達與可靶向目標 RNA 模塊融合的 ADAR 蛋白，實現(xiàn)位點特異性的 A-to-I 編輯，例如，REPAIR 系統(tǒng)。這些 RNA 堿基編輯器均能在細胞和動物體內(nèi)實現(xiàn)高效編輯，但持續(xù)性表達的 ADAR 導致大量的脫靶編輯，造成安全隱患。
為解決這一問題，研究者開發(fā)了多種可調(diào)控的 RNA 編輯器。這些技術(shù)均采用持續(xù)表達完整的 ADAR 蛋白的模式，在非誘導條件下具有很高本底活性，難以實現(xiàn)目標 RNA 的靈敏、可控的編輯。而過表達 ADAR 蛋白會造成較嚴重的轉(zhuǎn)錄組脫靶效應以及潛在的致癌風險。因此，亟需開發(fā)出一種調(diào)控嚴謹、更加安全、且具有高度時空特異性的 RNA 堿基編輯工具。
2025年3月31日，華東師范大學李大力團隊、劉明耀團隊和杜冰團隊在 Nature Biotechnology 期刊發(fā)表了題為：Engineering a photoactivatable A-to-I RNA base editor for gene therapy in vivo 的研究論文。
該研究開發(fā)了一種光激活 RNA 腺苷堿基編輯器——PA-rABE，該系統(tǒng)由 mini dCas13X 和光控 Magnets 系統(tǒng)驅(qū)動的分段 ADAR2dd 蛋白組成。在藍光照射下，光敏蛋白二聚化帶動分段 ADAR2dd 相互靠近恢復脫氨酶活性，從而實現(xiàn)時空特異性的 RNA 堿基編輯。
該研究采用的光控分段脫氨酶策略賦予 PA-rABE 高度光依賴性，不僅極大地降低了 ADAR 蛋白的轉(zhuǎn)錄組脫靶效應，還有效地規(guī)避了過表達外源 ADAR 蛋白帶來的潛在致癌風險。通過 AAV 遞送，PA-rABE 成功修復了 B 型血友病小鼠的凝血功能，展示了其在精準基因治療中的應用潛力。
為了評估 RNA 堿基編輯效率，研究團隊構(gòu)建了攜帶無義突變的 Gaussia 熒光素酶報告，簡稱 Gluc W160X。對 Gluc W160X 轉(zhuǎn)錄本上的 UAG 進行靶向編輯可以將終止密碼子轉(zhuǎn)換為 UIG 從而在功能上恢復 Gaussia 熒光素酶的活性，通過檢測熒光素酶的強度即可判斷 PA-rABE 的編輯效率。為了獲得編輯效率高且沒有泄露的 RNA 堿基編輯器，該團隊對 PA-rABE 系統(tǒng)中的 Cas 蛋白、ADAR2dd 的分段位點、各基因元件的相對位置、linker 序列、DR 個數(shù)及 Magnets 突變體等進行了系統(tǒng)地優(yōu)化。研究結(jié)果表明 PA-rABE 能靈敏地響應藍光在細胞內(nèi)實現(xiàn)可逆性的 RNA 編輯，不僅具有高度的空間特異性，還可以通過調(diào)節(jié)光照強度及時間靈敏地調(diào)控編輯活動的強弱。
圖1. PA-rABE系統(tǒng)的工作原理及特點表征
與非誘導的 RNA 堿基系統(tǒng)相比，PA-rABE 系統(tǒng)能高效地編輯內(nèi)源 RNA，在 10 個內(nèi)源轉(zhuǎn)錄本中的平均編輯率為 34.7%，高于 mxABE（~18.3%）和 REPAIRv2（~23.6%），且在轉(zhuǎn)錄組水平具有高度特異性。光照條件下，其編輯效率是近期報道的光激活 RNA 堿基編輯器 padCas13 的 2.1 倍，轉(zhuǎn)錄組水平的脫靶事件僅為 padCas13 編輯器的 2%。由此可見，光控分段 ADAR 策略不僅沒有削弱脫氨酶活性，還通過光調(diào)控實現(xiàn)了對脫氨酶活性的嚴格監(jiān)管，極大地降低了脫靶效應。此外，PA-rABE 聯(lián)合特定的 crRNA 能有效地將單個或連續(xù)的雙腺苷轉(zhuǎn)化為肌苷，為含有提前終止密碼子的遺傳疾病提供了一種新的治療方法。
為了探究 PA-rABE 在動物體內(nèi)的編輯效率，該團隊利用 PA-rABE 靶向外源 Fluc W426X 報告。該報告是一個失活的熒光素酶突變體，A-to-I 堿基轉(zhuǎn)換可以使 Fluc W426X 的終止密碼子 UAG 通讀為 UIG ，從而在功能上恢復熒光素酶活性?；铙w成像結(jié)果表明，PA-rABE 在光照條件下修復 Fluc W426X 產(chǎn)生的總熒光素酶強度是其在黑暗條件下總強度的 66 倍，是 padCas13 編輯器在光照下的 17.5 倍，證明了 PA-rABE 可以在體內(nèi)實現(xiàn)高效且嚴謹?shù)耐庠?nbsp;RNA 編輯。
為了進一步探究 PA-rABE 能否在體內(nèi)編輯內(nèi)源RNA，研究團隊將 minicircle 編碼的 PA-rABE 和 β-catenin 驅(qū)動表達的報告（TCF/LEF-Fluc）一起注射到小鼠體內(nèi)。光照條件下，PA-rABE 靶向 CTNNB1，將第 41 位氨基酸由蘇氨酸（T）轉(zhuǎn)換成丙氨酸（A），使其編碼的蛋白 β-catenin 在細胞質(zhì)中免被降解，進入細胞核后激活 TCF/LEF-Fluc 表達。研究結(jié)果表明，光照組小鼠的熒光素酶信號顯著增強，熒光素酶活性是黑暗組的 186 倍，證明 PA-rABE 能在體內(nèi)精準地編輯功能性內(nèi)源 RNA。此外，研究團隊還將 PA-rABE 系統(tǒng)用于疾病治療，通過 AAV 遞送系統(tǒng)，PA-rABE 成功地在光照條件下通讀 F9 基因，修復了 B 型血友病小鼠的凝血功能，展示了其在精準基因治療中的應用潛力，為精準調(diào)控治療性轉(zhuǎn)基因表達提供了概念驗證。
華東師范大學副研究員李慧瑩、博士研究生邱昱皓、碩士研究生宋博聞、權(quán)心怡為論文共同第一作者；華東師范大學為第一單位；華東師范大學李大力研究員、劉明耀教授和杜冰教授為共同通訊作者。
論文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41587-025-02610-2
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