強(qiáng)制降解研究的目的
強(qiáng)制降解研究在單克隆抗體治療藥物的整個(gè)生命周期中被廣泛用于支持多種目標(biāo)（表1）。監(jiān)管機(jī)構(gòu)也期望通過(guò)強(qiáng)制降解研究理解產(chǎn)品的降解途徑，并建立穩(wěn)定性指示方法以監(jiān)測(cè)保質(zhì)期內(nèi)可能發(fā)生的降解。此外，強(qiáng)制降解研究常用于評(píng)估可生產(chǎn)性、方法開發(fā)與驗(yàn)證、關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）評(píng)價(jià)以及產(chǎn)品變體的識(shí)別。
表1. 強(qiáng)制降解研究的目的與依據(jù)
常見(jiàn)強(qiáng)制降解條件下的主要降解途徑
常用強(qiáng)制降解條件包括高溫、凍融、振蕩、高pH、低pH、光照、氧化和糖化。這些條件雖嚴(yán)苛于實(shí)際儲(chǔ)存條件，但可在短時(shí)間內(nèi)生成相關(guān)降解產(chǎn)物。主要降解途徑總結(jié)如圖1。
圖1. 重組單克隆抗體的主要降解
途徑箭頭表示主要降解位點(diǎn)，括號(hào)內(nèi)為常用檢測(cè)方法。
高溫
高溫加速多種降解途徑，包括聚集（共價(jià)或非共價(jià)）、肽鍵斷裂（如鉸鏈區(qū)裂解）、天冬酰胺（Asn）脫酰胺化、甲硫氨酸氧化等。例如，中性或弱堿性條件下，高溫會(huì)通過(guò)β-消除導(dǎo)致二硫鍵降解，形成硫醚鍵交聯(lián)的不可逆聚集體。
凍融
凍融主要導(dǎo)致聚集體的形成（如二聚體和多聚體），其程度受pH、緩沖液濃度、鹽分和蛋白濃度影響?；瘜W(xué)降解在此條件下較少發(fā)生。
振蕩
振蕩通過(guò)增加抗體與疏水界面（如氣液界面）接觸，導(dǎo)致共價(jià)或非共價(jià)聚集。非天然二硫鍵的形成是共價(jià)聚集的主要原因，其程度受pH、鹽分、表面活性劑（如聚山梨酯）等因素調(diào)控。
低pH
低pH（如純化過(guò)程中的Protein A洗脫條件）誘導(dǎo)聚集、肽鍵斷裂（如鉸鏈區(qū)裂解）和天冬氨酸異構(gòu)化。天冬氨酸異構(gòu)化會(huì)生成中間體琥珀酰亞胺，并導(dǎo)致酸性物種增加。
高pH
高pH條件下，天冬酰胺脫酰胺化（如Fc段的“PNNY”肽段）成為標(biāo)志性降解途徑，同時(shí)加速聚集和肽鍵水解。此外，高pH可能引發(fā)二硫鍵重排，形成硫醚鍵或游離巰基。
光穩(wěn)定性
光照主要導(dǎo)致色氨酸、酪氨酸和甲硫氨酸氧化，并引發(fā)共價(jià)聚集。光氧化具有位點(diǎn)選擇性，例如甲硫氨酸氧化傾向于同一重鏈，而化學(xué)氧化則隨機(jī)分布。
氧化
氧化劑（如過(guò)氧化氫）主要導(dǎo)致甲硫氨酸氧化為甲硫氨酸亞砜或砜，其中CH2域的Met252和CH3域的Met428因表面暴露度高而最易被氧化。氧化還可能引發(fā)聚集和構(gòu)象變化。
糖化
糖化是還原糖與抗體賴氨酸側(cè)鏈或N端氨基的非酶促反應(yīng)，導(dǎo)致分子量增加162 Da。糖化水平受溫度、pH、糖濃度等因素影響，可能影響抗體結(jié)合活性或誘導(dǎo)聚集。
強(qiáng)制降解研究的應(yīng)用
預(yù)篩選
預(yù)篩選旨在確定能產(chǎn)生有意義降解水平的條件。常用方法包括尺寸排阻色譜（SEC）檢測(cè)聚集、陽(yáng)離子交換色譜（CEX）檢測(cè)電荷變化以及液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）鑒定氧化或糖化位點(diǎn)。
表2. 推薦的預(yù)篩選條件與方法
應(yīng)用領(lǐng)域
強(qiáng)制降解研究貫穿藥物開發(fā)生命周期（表3），包括候選分子篩選、配方開發(fā)、方法驗(yàn)證、雜質(zhì)鑒定、可比性評(píng)估等。例如，在可比性研究中，強(qiáng)制降解可揭示常規(guī)分析無(wú)法檢測(cè)的差異，確保工藝變更后產(chǎn)品質(zhì)量一致。
表3. 強(qiáng)制降解研究在mAb生命周期中的應(yīng)用
監(jiān)管指導(dǎo)方針
強(qiáng)制降解相關(guān)要求分散于多個(gè)ICH、FDA和EMA文件中（表4）。例如，ICH Q5C強(qiáng)調(diào)需通過(guò)極端條件理解降解途徑，ICH Q1B規(guī)范了光穩(wěn)定性測(cè)試，而ICH Q5E則支持可比性研究中的數(shù)據(jù)應(yīng)用。
表4. 相關(guān)監(jiān)管指導(dǎo)文件
結(jié)論
強(qiáng)制降解研究是重組單克隆抗體開發(fā)中的關(guān)鍵工具，貫穿從早期候選篩選到上市后可比性評(píng)估的全過(guò)程。通過(guò)合理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)條件，可深入理解抗體的生化特性，支持配方優(yōu)化、方法驗(yàn)證和監(jiān)管申報(bào)。未來(lái)，隨著生物類似藥和復(fù)雜抗體療法的興起，強(qiáng)制降解研究的重要性將進(jìn)一步凸顯。
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