Protein A 親和層析是一種高效且特異性強的純化技術(shù)，廣泛應(yīng)用于單克隆抗體(mAb)及具有Fc結(jié)構(gòu)域的分子如融合蛋白和雙特異性抗體的捕獲。然而，傳統(tǒng)的Protein A 親和層析在洗脫過程中需要使用低pH(3.0-4.0)，這不僅可能導致對低pH敏感的分子產(chǎn)物降解，例如碎片化、聚集等，而且對產(chǎn)品的穩(wěn)定性和質(zhì)量產(chǎn)生不利影響。

為了解決這一問題，研究人員開發(fā)了新型的Protein A 填料，其配基設(shè)計經(jīng)過優(yōu)化，能夠在較溫和的pH條件下實現(xiàn)洗脫。例如，Purolite公司推出的Praesto Jetted A50 HipH填料，通過對其Fc和VH3結(jié)合區(qū)的序列進行修改，使其能夠在pH 4.6或更高的條件下洗脫Fc融合蛋白和大多數(shù)mAb。優(yōu)化后的洗脫和洗滌條件不僅實現(xiàn)了高回收率(>90%單體收率)，還顯著減少了高分子量(HMW)物質(zhì)(>50%)，并在盡可能溫和的洗脫pH下有效清除了宿主細胞蛋白(HCP)。

對于pH穩(wěn)定的mAb和pH敏感的融合蛋白，在優(yōu)化條件下進行細胞培養(yǎng)物料的純化，結(jié)果表明，溫和洗脫pH填料能夠以可接受的收率純化產(chǎn)物，雜質(zhì)清除率相當或更好，且與傳統(tǒng)填料相比，天然洗脫液pH明顯更溫和。特別是在pH敏感蛋白的純化中，優(yōu)勢更加明顯，使用溫和洗脫緩沖液和天然洗脫pH，洗脫液中HMW含量在48小時內(nèi)僅有2%保持穩(wěn)定。而傳統(tǒng)需要低pH洗脫的Protein A填料，洗脫液HMW水平則為8%，在相同保持時間內(nèi)增加到16%。

此外，這些新型填料還具有高動態(tài)結(jié)合載量，并允許使用傳統(tǒng)的HCP洗滌方法。因此，Praesto Jetted A50 HipH填料成為平臺Protein A填料的理想候選者，為pH敏感蛋白和穩(wěn)定的mAb提供了更大的靈活性，同時確保了產(chǎn)物質(zhì)量、收率以及與下游工藝的無縫集成。

亮點

?ProA 配基的 Fc 和VH3 結(jié)合區(qū)的修改可以允許溫和的洗脫 pH。

?Jetted A50 HipH 可以在 pH 4.6 或以上時洗脫含 Fc 的蛋白質(zhì)。

?可以實現(xiàn)溫和的洗脫 pH 值并實現(xiàn)高收率以及 >50% 的 HMW 減少率。

?pH敏感蛋白質(zhì)可以在穩(wěn)定的pH區(qū)域內(nèi)洗脫，并且隨時間保持穩(wěn)定。

? Jetted A50 HipH 是一種適用于穩(wěn)定和不穩(wěn)定蛋白質(zhì)的靈活平臺 ProA 填料。

簡介

自20世紀80年代以來，抗體及其相關(guān)產(chǎn)品的市場經(jīng)歷了顯著的增長，逐漸成為生物制藥領(lǐng)域中的主導產(chǎn)品類別。這一增長趨勢不僅推動了對這些產(chǎn)品需求的不斷攀升，也促使上游和下游工藝技術(shù)迅速發(fā)展，以滿足日益增長的市場需求。

在單克隆抗體(mAb)或Fc融合蛋白的純化過程中，Protein A親和層析作為一種關(guān)鍵的初步捕獲步驟，被廣泛應(yīng)用于從細胞培養(yǎng)收獲物中分離目標產(chǎn)物。該技術(shù)利用來自金黃色葡萄球菌或大腸桿菌的天然或重組Protein A配基，將其與基質(zhì)偶聯(lián)，以實現(xiàn)對目標分子的特異性結(jié)合。

天然Protein A由五個同源結(jié)構(gòu)域(E、D、A、B和C)組成，這些結(jié)構(gòu)域均能與免疫球蛋白G(IgG)的Fc區(qū)發(fā)生相互作用，尤其對IgG1、IgG2和IgG4亞型表現(xiàn)出較強的親和力。由于Protein A填料具有高選擇性和結(jié)合親和力，它們在蛋白質(zhì)純化過程中被廣泛應(yīng)用于含F(xiàn)c分子的平臺方法中，成為不可或缺的一部分。

為了進一步提升Protein A填料的性能，多年來研究人員通過工程改造Protein A配基或填料基質(zhì)，做出了諸多努力和改進。這些改造主要集中在提高填料的結(jié)合載量和堿穩(wěn)定性方面，以滿足工業(yè)生產(chǎn)中對高效率和高純度蛋白質(zhì)純化的需求。通過這些不斷的技術(shù)創(chuàng)新和優(yōu)化，Protein A親和層析技術(shù)得以在生物制藥領(lǐng)域持續(xù)發(fā)揮其重要作用，為抗體和抗體相關(guān)產(chǎn)品的生產(chǎn)提供了有力支持。

在生物制藥領(lǐng)域，Protein A填料是單克隆抗體(mAb)純化過程中不可或缺的工具，其通過與抗體的Fc區(qū)域特異性結(jié)合，實現(xiàn)高效的捕獲和純化。然而，對于Fc融合蛋白等對低pH敏感的蛋白質(zhì)，傳統(tǒng)的Protein A填料在低pH洗脫條件下可能會導致蛋白質(zhì)聚集，增加免疫原性風險，影響藥物的安全性和有效性。因此，開發(fā)新型的Protein A填料或優(yōu)化純化工藝，以降低低pH敏感蛋白質(zhì)的聚集風險，對于提高Fc融合蛋白等藥物的生產(chǎn)質(zhì)量和效率具有重要意義。

研究表明，在洗脫緩沖液中添加穩(wěn)定劑或采用提高洗脫pH值的策略，例如使用高濃度的氯化鈉、氯化鎂或精氨酸溶液，可有效抑制聚體的形成。然而，為了與后續(xù)的精純步驟更好地銜接，通常需要額外的步驟來去除這些添加物，以達到預(yù)期的效果。

針對對低pH敏感的分子，一種Protein A層析的策略是直接中和洗脫液，以減少其在低pH條件下的暴露時間，從而大程度地降低聚體的形成。這需要在收集容器中預(yù)先準備好適量的中和緩沖液，以便洗脫液一加入即被中和。中和緩沖液與洗脫液的準確體積和比例至關(guān)重要，以確保洗脫液的pH值迅速進入分子穩(wěn)定的范圍。這種策略可以有效減少蛋白質(zhì)聚集，使得傳統(tǒng)的Protein A層析可用于純化低pH敏感分子。然而，該方法需要精確控制，以確保在大規(guī)模生產(chǎn)中能夠快速且充分地混合，這增加了工藝的復雜度。此外，該工藝的穩(wěn)定性和靈活性較差，因為必須根據(jù)預(yù)定的洗脫體積提前制備中和緩沖液體積。對于那些在低pH洗脫過程中容易在柱上快速聚集的分子，該策略的應(yīng)用也受到限制。

為了應(yīng)對純化pH敏感抗體和Fc融合蛋白所面臨的挑戰(zhàn)，Repligen與Navigo Proteins合作，開發(fā)出了一種新型的Protein A原型填料，該填料具備在較溫和的pH條件下進行洗脫的能力。具體來說，研究人員通過對五個Protein A野生型結(jié)構(gòu)域的序列片段進行重組，創(chuàng)造出全新的Protein A樣序列，從而制備出一種“人造”的馬賽克式Protein A等價物。此外，通過在不同位置引入定點突變，構(gòu)建了一個小型的突變庫，并從中篩選出具有更優(yōu)洗脫pH特性的配基。實驗結(jié)果表明，將野生型氨基酸替換為組氨酸可以最有效地提高洗脫pH。由于這些序列修改發(fā)生在Protein A分子的Fc和VH3結(jié)合區(qū)內(nèi)，因此與野生型序列相比，在較溫和的酸性pH下，其結(jié)合親和力有所降低，但保留了在中性pH下的Fc結(jié)合親和力，以促進產(chǎn)物的結(jié)合。通過篩選過程，研究人員確定了數(shù)種能夠在較溫和pH下洗脫的Protein A配基候選物。最終，選擇了兩種配基作為主要候選配基，它們均能在較溫和的pH下實現(xiàn)洗脫，同時保持較高的結(jié)合載量。盡管Protein A的主要結(jié)合活性是通過抗體的Fc部分實現(xiàn)的，但它也能以不同的模式與VH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合。這兩種候選配基在與抗體VH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合的能力上存在差異：其中一種候選配基僅對非VH3抗體表現(xiàn)出溫和的洗脫能力，而另一種候選配基則在VH3結(jié)合區(qū)含有額外的氨基酸突變，使其對VH3和非VH3抗體均具有溫和的洗脫能力。利用這兩種主要候選配基，研究人員制備了兩種原型填料，并對其性能進行了評估，相關(guān)結(jié)果詳見本文。

隨后，Repligen和Navigo Proteins與Purolite合作，致力于將該原型填料進行放大和商業(yè)化。該原型填料能夠?qū)H3和非VH3抗體均實現(xiàn)溫和的洗脫，并最終被商業(yè)化為Praesto® Jetted A50 HipH填料。Praesto® Jetted A50 HipH填料結(jié)合了Repligen的NGL-Impact A HipH配基，并采用了Purolite的噴射技術(shù)制造的Jetted A50基礎(chǔ)基質(zhì)。

隨著抗體相關(guān)候選藥物組合的日益多樣化，對Protein A層析過程中更靈活的洗脫條件的需求也在不斷增長。在本研究中，我們對兩種專為較溫和pH洗脫設(shè)計的Protein A填料（Jetted A50 HipH和原型HipH-002）進行了評估，并將其與兩種廣泛使用的商用Protein A填料（Jetted A50和MabSelect SuRe）進行了比較，主要考察了它們的洗脫pH、動態(tài)結(jié)合載量（DBC）以及雜質(zhì)去除能力。此外，我們還通過穩(wěn)定性研究，檢驗了洗脫pH對pH敏感分子的影響。

詳細的實驗操作和結(jié)果，請參考原文。

實驗中使用的填料的性質(zhì)

結(jié)果

脈沖注射實驗

對表中列出的四種 Protein A 填料進行脈沖進樣，然后以 pH 7.0 至 3.0 的線性 pH梯度進行洗脫。如圖 1、圖 2所示，對于所有測試的分子，Jetted A50 HipH 和 HipH-002 填料的洗脫 pH 明顯高于現(xiàn)有的 Protein A 填料（Jetted A50 和 MabSelect SuRe）。

圖 1.Protein A 填料上 Fc1 的洗脫 pH 值，定義為 UV 峰最大值的pH 值，通過 pH 7.0 至 3.0 的線性 pH 梯度脈沖注射確定。

圖 2. 5種mAb 在Protein A 填料上的洗脫 pH 值比較（定義為 UV 峰最大值的 pH 值），通過pH 7.0 至 3.0 的線性 pH 梯度脈沖注射確定。

圖 1顯示了線性 pH 梯度上 Fc1 洗脫曲線的 UV 軌跡。對于Fc1，在填料 Jetted A50 HipH 和HipH-002 上，洗脫峰最大值時的 pH 分別為 4.8 和 5.2。傳統(tǒng)Protein A 填料Jetted A50 和 MabSelect SuRe 的峰最大值分別為 pH 3.5 和 3.4。Fc1 是一種 Fc 融合蛋白，據(jù)觀察，在 pH 4.5 以下時聚體形成增加。使用傳統(tǒng)Protein A 填料時，需要低 pH 緩沖液來洗脫 Fc1，并且需要直接中和策略來最大限度地減少分子在低 pH 條件下的暴露時間。相比之下，本研究中評估的 HipH 填料提供了明顯更高的洗脫 pH，這使得可以直接回收穩(wěn)定 pH 區(qū)域（> pH 4.5）內(nèi)的 Fc1。

圖 2總結(jié)了所評估的5種 mAb 的洗脫 pH。對于所有分子，傳統(tǒng)Protein A 填料始終在 pH 3.4–3.7 下洗脫，表明需要低 pH 值才能打破 mAb 與傳統(tǒng)Protein A 配基之間的相互作用。Jetted A50 HipH 對mAb 2–5 顯示出非常一致的溫和洗脫 pH，洗脫峰最大值在pH 4.6 和 4.7 之間。研究中的一個例外是 mAb1，其洗脫峰最大值發(fā)生在 pH 4.2。這種差異可能歸因于 mAb1 的序列或結(jié)構(gòu)，這導致 mAb 與 Jetted A50 HipH 配基之間產(chǎn)生更強的結(jié)合相互作用。HippH-002 對測試的 mAb 具有更多可變的洗脫 pH，洗脫峰最大值范圍為 pH 3.7 至 4.7。與 Jetted A50 HipH 填料相比，mAb 2、3 和 4 在 HipH-002 填料上的洗脫 pH 值較低，表明與 HipH-002 配基的結(jié)合親和力更強。這歸因于 HipH-002 配基的 VH3 結(jié)合親和力，因為這三種 mAb 均源自人 VH3 家族。此外，不同的 VH3 序列可能導致對相同配基的不同親和力，這可以解釋 mAb 2、3 和 4 在 HipH-002 上的洗脫pH 值差異。源自人 VH1 家族的 mAb 1 和 mAb 5 在 Jetted A50 HipH和 HipH-002 上具有相似的洗脫 pH 值。

實驗結(jié)果表明，由于對Jetted A50 HipH和HipH-002配基進行了序列上的改良，這兩種填料均能在比傳統(tǒng)填料更溫和的pH條件下實現(xiàn)洗脫。原型HipH-002配基僅對非VH3抗體表現(xiàn)出穩(wěn)定的洗脫性能，這是因為其對VH3區(qū)域的結(jié)合親和力可能因特定VH3序列的不同而存在更寬的洗脫pH范圍。相比之下，Jetted A50 HipH是一種更為通用的溫和洗脫pH填料，適用于所有含F(xiàn)c的蛋白質(zhì)，不受IgG類型或VH家族的限制。由于Jetted A50 HipH配基在VH3結(jié)合區(qū)引入了額外的突變，使其能夠溫和地洗脫VH3和非VH3抗體，因此與傳統(tǒng)Protein A填料相比，預(yù)計所有含F(xiàn)c的蛋白質(zhì)都可以在更溫和的洗脫pH下實現(xiàn)洗脫。然而，對于每種目標蛋白質(zhì)，仍需進行實際實驗以了解其具體的洗脫行為。在本研究中評估的6種蛋白質(zhì)中，有5種在pH 4.6以上從Jetted A50 HipH中洗脫，而所有蛋白質(zhì)均在pH 4.2以上洗脫。相比之下，Pabst等人評估了9種分子在12種市售傳統(tǒng)Protein A填料上的洗脫pH行為，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)蛋白質(zhì)-填料組合的洗脫pH范圍為3.5-3.8。對于傳統(tǒng)Protein A填料而言，F(xiàn)c結(jié)合親和力僅在低pH條件下（如<pH 4.0）降低，蛋白質(zhì)也只能在此pH以下洗脫。而HipH配基的修飾序列則在較溫和的酸性pH下降低了Fc結(jié)合親和力，從而允許在更溫和的pH條件下實現(xiàn)洗脫。

動態(tài)結(jié)合載量

在6分鐘的保留時間內(nèi)，使用四種Protein A填料測定了mAb1、mAb2和Fc1在10%穿透時的動態(tài)結(jié)合載量（DBC）。表3總結(jié)了這三種分子在四種填料上獲得的DBC值。由于Fc1的分子量大約是典型單克隆抗體的一半，因此其每單位體積填料的蛋白質(zhì)質(zhì)量動態(tài)結(jié)合載量預(yù)期較低。對于Fc1，Jetted A50 HipH和HipH-002的結(jié)合載量介于MabSelect SuRe和Jetted A50之間。需要注意的是，由于每種融合分子的設(shè)計都是獨特的，因此這些數(shù)據(jù)可能無法預(yù)測其他Fc融合蛋白的性能。對于mAb1和mAb2，Jetted A50 HipH和HipH-002展現(xiàn)出與Jetted A50相當?shù)母邉討B(tài)結(jié)合載量，且比MabSelect SuRe的動態(tài)結(jié)合載量高出40-70%。這一結(jié)果在意料之中，因為HipH填料與Jetted A50共享相同的基礎(chǔ)填料基球。

表3.4種 Protein A 填料上 mAb 和Fc 融合蛋白的動態(tài)結(jié)合載量。

高分子量（HMW）餾分的梯度洗脫實驗

盡管Protein A層析通常不降低高分子量（HMW）雜質(zhì)的水平，但先前的研究指出，通過線性pH梯度洗脫可以實現(xiàn)聚體和單體的分離，因為聚體對配基的親和力更強。然而，在傳統(tǒng)Protein A填料上，找到一個穩(wěn)定的操作空間以選擇性地洗脫單體是非常具有挑戰(zhàn)性的。

圖3展示了四種Protein A填料在20個柱體積（CV）洗脫梯度過程中，F(xiàn)c1的紫外（UV）吸收軌跡，其中pH值逐漸降低。色譜圖上疊加的圖表顯示了各餾分中收集的累積高分子量（HMW）雜質(zhì)回收率。對于所有四種Protein A填料，UV軌跡上均出現(xiàn)了一個后肩，表明后續(xù)餾分中含有較高比例的HMW雜質(zhì)，這說明HMW雜質(zhì)與填料的結(jié)合更為牢固，需要更低的pH值才能實現(xiàn)洗脫。由于HipH填料能夠在較溫和的pH條件下實現(xiàn)洗脫，因此與現(xiàn)有的Protein A填料相比，其在單體和聚體的分離度上表現(xiàn)得更為出色。表4比較了UV峰最大值出現(xiàn)時的pH值（代表大多數(shù)蛋白質(zhì)洗脫的位置）以及實現(xiàn)50% HMW雜質(zhì)去除的pH值，后者相當于累積HMW雜質(zhì)回收率達到50%。在這兩個pH值之間進行洗脫，可以在獲得高蛋白質(zhì)回收率的同時，實現(xiàn)超過50%的HMW雜質(zhì)去除率。對于HipH填料，UV峰最大值和50% HMW雜質(zhì)去除率之間的pH差異為0.6個pH單位，而傳統(tǒng)填料的pH差異僅為0.3個pH單位。HipH填料的pH差異較大，表明單體與聚體之間的結(jié)合親和力差異更為顯著，從而為提高該純化步驟的純度提供了更大的操作空間。

圖 3. Protein A 填料上 Fc1 的紫外吸光度和累積 HMW 回收率。所有運行均采用 20 CV 下降線性梯度，Jetted A50 HipH 和 HipH-002 從 pH 7.0 下降至 3.0，Jetted A50 和MabSelect SuRe 從 pH 4.5 下降至 3.0。收集餾分以測量每個餾分中的 HMW 水平，并計算與上樣中的 HMW 相比的累積洗脫 HMW。

表4. 在4種Protein A 填料上使用線性梯度分離 HMW。

較溫和的洗脫pH填料為洗脫條件提供了更寬的操作范圍，從而使得在Protein A層析過程中能更有效地去除高分子量（HMW）雜質(zhì)。洗脫pH可根據(jù)分子特性進一步優(yōu)化，以在收率和HMW雜質(zhì)去除之間達到最佳平衡。在Protein A捕獲步驟中顯著降低HMW雜質(zhì)含量，可減輕后續(xù)精純步驟的雜質(zhì)去除壓力，進而提升整個下游工藝的效率。

等度洗脫評價

根據(jù)線性梯度上 mAb1 和 Fc1 的洗脫峰最大 pH 值，對它們進行了等度洗脫運行，評估了幾種不同的洗脫 pH 值。每次運行的載量為 DBC 載量的 85%，穿透率為 10%。

圖 4總結(jié)了等度洗脫實驗中的單體收率和洗脫液 HMW 結(jié)果。圖中顯示的是單體收率，而不是總收率，以考慮被去除的聚體量。

圖 4. 使用Fc1 和 mAb1 在Protein A 填料上進行等度洗脫實驗時單體收率和洗脫液 HMW 水平。Fc1 測試了 5 個洗脫 pH，最高 pH 為 5.5；mAb1 測試了 4 個洗脫 pH，最高 pH 為 4.4。上樣中的起始 HMW水平為 Fc1 的 7.1% 和 mAb1 的 8.7%。由于產(chǎn)物回收率低，沒有對所有 Jetted A50 和 MabSelect SuRe 洗脫液進行 HMW 測量。

圖4左側(cè)的圖表匯總了Fc1的等度洗脫實驗結(jié)果，洗脫緩沖液的pH值分別為5.5、5.2、4.9、4.6和3.5。對于HipH-002填料，在洗脫pH值為5.2或更低時，單體收率超過88%。在pH值5.5和5.2時，HipH-002的收率高于Jetted A50 HipH。這一觀察結(jié)果與脈沖注射和梯度洗脫數(shù)據(jù)相一致，其中HipH-002的洗脫峰最大pH值高于Jetted A50 HipH。正如預(yù)期，Jetted A50和MabSelect SuRe僅在洗脫pH值為3.5時才能實現(xiàn)高收率。需要低pH值才能將分子從傳統(tǒng)的Protein A填料上洗脫，但這也會導致結(jié)合在柱上的HMW雜質(zhì)一同洗脫，使得HMW雜質(zhì)的去除率極低。相比之下，在Jetted A50 HipH和HipH-002上使用pH 5.2進行洗脫，可獲得高Fc1收率，且洗脫液中的HMW雜質(zhì)水平分別從上樣中的7.1%降低至2.0%和2.9%。這表明HipH填料具有額外的優(yōu)勢，即通過擴大洗脫pH范圍來改善聚體的去除。

圖4右側(cè)的圖表匯總了使用pH值為4.4、4.2、4.0和3.5的洗脫緩沖液對mAb1進行等度洗脫實驗的結(jié)果。當洗脫pH值為4.4或更低時，HipH填料的單體收率超過90%。在pH 4.4時，Jetted A50 HipH的收率略高于HipH-002，這與脈沖注射數(shù)據(jù)一致，其中Jetted A50 HipH的洗脫峰最大pH略高于HipH-002。與Fc1類似，使用Jetted A50和MabSelect SuRe純化mAb1時，僅在采用pH為3.5的洗脫緩沖液時才能獲得高收率，但此時HMW雜質(zhì)的去除率極低。相比之下，當在Jetted A50 HipH和HipH-002上以pH 4.4進行洗脫時，洗脫液中的HMW雜質(zhì)水平分別從上樣中的8.7%降低至4.7%和4.2%。

在后續(xù)討論的實驗中，針對每種分子選擇具有最溫和洗脫pH值的HipH填料，用于洗滌緩沖液的篩選，并利用澄清的細胞培養(yǎng)收獲物來評估工藝性能和產(chǎn)物質(zhì)量。具體而言，對于Fc1的純化，進一步在HipH-002上進行評估；而對于mAb1的純化，則進一步在Jetted A50 HipH上進行評估。

洗滌條件評估

Protein A層析對含F(xiàn)c蛋白具有高選擇性和親和力，有望高效清除工藝相關(guān)雜質(zhì)，如宿主細胞蛋白（HCP）?？梢酝ㄟ^使用不同的添加物或調(diào)節(jié)pH值的中間洗滌步驟來增強對松散結(jié)合的HCP甚至難以去除的HCP的清除效果。這被證明是減輕后續(xù)精純步驟負擔的關(guān)鍵有效方法。因此，本文評估了表5和表6中列出的Protein A層析常用洗滌緩沖液在HipH填料上清除HCP的效果及其對產(chǎn)量的影響。此次評估的目的是確定，在HipH填料的結(jié)合親和力發(fā)生變化的情況下，使用傳統(tǒng)洗滌緩沖液是否仍能有效清除HCP并實現(xiàn)高回收率。

表5.不同洗滌緩沖液對Fc1的收率和宿主細胞蛋白清除率的影響。

表6.不同洗滌緩沖液對mAb1收率和宿主細胞蛋白清除率的影響

在HipH-002上對Fc1進行洗滌評估實驗，使用表5所示的8種不同洗滌劑各三個柱體積，并采用pH為5.2的洗脫緩沖液。每次運行的收率均標準化為無洗滌對照運行的收率，以確定洗滌步驟導致的具體收率損失。50 mM辛酸鈉與1 M精氨酸（pH 7.0）的組合以及1 M精氨酸（pH 6.5）的組合可實現(xiàn)最高的HCP清除率。這一結(jié)果與之前在傳統(tǒng)Protein A填料上清除Fc1的HCP的經(jīng)驗相符。為了在收率和HCP清除率之間取得平衡，50 mM辛酸鈉和1 M精氨酸（pH 7.0）被確定為Fc1 HCP清除的最佳洗滌劑組合。同樣，在Jetted A50 HipH上對Fc1進行了洗滌緩沖液篩選，使用相同的洗脫緩沖液pH 5.2和表5所示的洗滌緩沖液，顯示出與HipH-002相似的收率和HCP去除趨勢。然而，與HipH-002上的運行相比，Jetted A50 HipH上所有運行的收率略低（數(shù)據(jù)未展示），這與等度洗脫評估的預(yù)期一致。

此外，當采用1 M pH 6.0的精氨酸作為洗滌緩沖液時，洗滌過程中的收率損失達到65%。這一結(jié)果表明，高濃度的精氨酸和較低的pH值在削弱蛋白質(zhì)與配基之間的相互作用方面發(fā)揮了重要作用。這也意味著，若需采用更溫和的pH值，可在溫和洗脫pH填料上添加精氨酸等改性劑，以進一步提升洗脫pH值。

對于mAb1，在Jetted A50 HipH上使用表6中所示的6種洗滌緩沖液各三倍柱體積，并采用pH為4.4的洗脫緩沖液進行洗滌評估實驗。初步研究表明，使用pH為6.5的洗滌緩沖液會導致顯著的收率損失，因此這些緩沖液未被包含在mAb1的洗滌評估中。含有1 M精氨酸和50 mM辛酸鈉的洗滌條件與無洗滌運行相比導致收率損失，并展示了HCP去除與回收率之間的權(quán)衡。為了在收率和HCP清除率之間取得平衡，確定pH為7.0的0.5 M精氨酸是mAb1 HCP清除的最佳洗滌劑。同樣，在HipH-002上對mAb1進行了洗滌緩沖液篩選，使用相同的pH為4.4的洗脫緩沖液和表6中所示的洗滌緩沖液，顯示出與Jetted A50 HipH相似的收率和HCP去除趨勢。然而，與Jetted A50 HipH上的運行相比，HipH-002上所有運行的收率都略低，這與等度洗脫評估的預(yù)期一致。

總體而言，這些結(jié)果表明，在傳統(tǒng)Protein A填料上用于清除宿主細胞蛋白（HCP）的常用洗滌緩沖液也能成功地去除溫和洗脫pH填料上的HCP。由于與HCP的相互作用具有分子特異性，因此需要針對每種目標蛋白確定最佳的洗滌緩沖液。pH低于7.0的洗滌緩沖液可能有助于提高HCP去除率，但通常會以降低收率或上樣密度為代價，因為在這些洗滌條件下，蛋白質(zhì)可能會被部分洗脫。

在優(yōu)化條件下純化澄清的細胞培養(yǎng)物

對澄清的細胞培養(yǎng)收獲物進行純化，以評估與傳統(tǒng)填料相比，溫和洗脫pH Protein A層析填料在最佳條件下對Fc1和mAb1的選擇性純化能力。Fc1在HipH-002上進行純化，洗脫pH設(shè)定為5.2；mAb1則在Jetted A50 HipH上進行純化，洗脫pH設(shè)定為4.4。將這些經(jīng)過優(yōu)化的溫和洗脫運行結(jié)果與在Jetted A50和MabSelect SuRe上、洗脫pH為3.5的純化運行結(jié)果進行比較。所有Fc1的運行過程中均加入了50 mM辛酸鈉和1 M精氨酸（pH 7.0）的中間HCP洗滌液；所有mAb1的運行過程中均加入了0.5 M精氨酸（pH 7.0）。

表7總結(jié)了在最佳溫和洗脫pH填料上純化后洗脫液的工藝性能和產(chǎn)物質(zhì)量，并將其與兩種傳統(tǒng)Protein A填料進行了比較。對于Fc1，HipH-002上的收率與兩種傳統(tǒng)Protein A填料相當，后者的洗脫液中HMW水平較低。這是因為HipH-002上的洗脫pH更高，且柱上HMW物質(zhì)與單體的分離效果更好。使用pH 5.2的洗脫緩沖液時，洗脫pH低于梯度實驗中UV峰最大值出現(xiàn)的pH（pH 5.7），從而實現(xiàn)了蛋白質(zhì)的高回收率。pH 5.2也高于發(fā)生50% HMW去除的pH（pH 5.0），這表明在該洗脫pH下，大部分HMW仍然與柱結(jié)合，從而在Protein A步驟中更有效地去除了HMW。此外，與傳統(tǒng)Protein A填料相比，HipH-002的HCP清除率相當。

表7. 細胞培養(yǎng)收獲物純化的工藝性能和洗脫產(chǎn)物質(zhì)量。

對于mAb1，在Jetted A50 HipH上的收率相較于傳統(tǒng)Protein A填料大約低了10%。在此次使用細胞培養(yǎng)材料作為上樣的運行中，觀察到洗滌步驟中存在收率損失，推測這可能是由于分子與配基之間的結(jié)合強度減弱所致。而當使用Protein A洗脫液作為上樣材料時，在相同的洗滌和洗脫條件下，洗滌步驟中的收率損失最小。這表明，使用細胞培養(yǎng)材料而非純化蛋白作為上樣的等度洗脫和洗滌評估實驗，可能會對收率方面的最佳洗滌和洗脫緩沖液選擇得出不同的結(jié)論。此外，由于洗脫pH緩沖液較為溫和，Jetted A50 HipH上的洗脫液峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，導致峰收集不完整，從而使得收率較低。采用pH稍低的洗脫緩沖液或增加洗脫體積可以提高回收率。相比之下，Jetted A50或MabSelect SuRe在中間洗滌中沒有損失，其洗脫峰非常尖銳。與Fc1類似，Jetted A50 HipH的洗脫pH值較高（4.4），有助于提高HMW清除率，使得結(jié)合力更強的HMW物質(zhì)留在柱上。Jetted A50 HipH上的HCP清除率也與傳統(tǒng)Protein A填料相當。

表7僅展示了使用最溫和洗脫pH的最佳HipH填料的結(jié)果，以凸顯其優(yōu)勢。此外，還使用與最佳HipH填料相同的洗脫和洗滌緩沖液，在Jetted A50上對Fc1進行細胞培養(yǎng)純化，在HipH-002上對mAb1進行細胞培養(yǎng)純化，結(jié)果表明HipH填料能夠在比傳統(tǒng)Protein A填料更溫和的pH條件下實現(xiàn)洗脫，同時有效去除HMW和HCP雜質(zhì)。然而，與HipH-002相比，Jetted A50 HipH上使用Fc1的收率略低；與Jetted A50相比，在HipH-002上使用mAb1的產(chǎn)量略低，這與等度洗脫評估的預(yù)期一致。因此，需要針對每種目標蛋白質(zhì)和每種填料確定最佳的緩沖液和運行條件，以在收率、雜質(zhì)去除和洗脫液pH（如有必要）之間取得最佳平衡。

Protein A層析通常不用于去除高分子量（HMW）雜質(zhì)，因為疏水相互作用層析（HIC）和陽離子交換層析（CEX）等模式在這方面更為有效。然而，在工藝早期去除雜質(zhì)有助于減輕后續(xù)精純步驟的負擔，從而實現(xiàn)更高的上樣量和提高收率。盡管已有研究證明Protein A層析能夠分離HMW和單體，但所需條件往往導致收率不理想或需要添加鹽。由于回收率低或與后續(xù)步驟的工藝連接困難，這兩種選擇對于大規(guī)模生產(chǎn)來說都是不理想或不可行的。使用標準Protein A方案，HipH填料能夠顯著降低HMW含量并獲得可接受的收率，只需改變洗脫pH值即可。

洗脫pH對pH敏感分子的影響

在上一節(jié)中討論的HipH-002、Jetted A50和MabSelect SuRe細胞培養(yǎng)運行中，天然Fc1洗脫物的穩(wěn)定性在48小時內(nèi)進行了評估。HipH-002使用pH 5.2的洗脫緩沖液進行洗脫，而Jetted A50和MabSelect SuRe則使用pH 3.5的洗脫緩沖液進行洗脫。

表7展示了洗脫完成后10分鐘內(nèi)測定的Fc1天然洗脫液的pH值和洗脫液中的HMW水平。從圖5可以看出，與HipH-002相比，Jetted A50和MabSelect SuRe的天然洗脫液起始HMW水平更高。這可能是由于在柱上發(fā)生或快速聚集和HMW分離的結(jié)合所致。已知Fc1在pH低于4.5時不穩(wěn)定。因此，在Jetted A50和MabSelect SuRe上使用低pH洗脫可能會導致在柱洗脫時以及收集的洗脫液中發(fā)生聚集，因為天然洗脫液的pH值分別為3.7和3.9。此外，由于HMW與柱的結(jié)合更強，與傳統(tǒng)Protein A填料（將HMW與產(chǎn)物一起洗脫）所需的低pH值洗脫相比，HipH-002上較溫和的pH值洗脫可以選擇性地洗脫產(chǎn)物，而保持HMW結(jié)合。傳統(tǒng)的Protein A洗脫液在低pH下48小時內(nèi)不穩(wěn)定，Jetted A50洗脫液的HMW從4.9%增加到9.1%，MabSelect SuRe洗脫液的HMW從8.3%增加到16.4%。相比之下，天然HipH-002洗脫液的pH高于4.5，HMW水平在48小時內(nèi)保持穩(wěn)定。由于HipH填料可以用較溫和的洗脫pH洗脫，因此Protein A洗脫液的純度和穩(wěn)定性都有所提高。

圖 5.天然 Fc1 Protein A 洗脫物的穩(wěn)定性。使用 HipH-002、Jetted A50 和 MabSelect SuRe 在優(yōu)化條件下從澄清細胞培養(yǎng)液中純化后 48 小時內(nèi)天然 Fc1 Protein A 洗脫物的 HMW 水平比較。

Jetted A50 HipH 實施注意事項

為了加速工藝開發(fā)進程，公司通常采用適用于大多數(shù)產(chǎn)物的平臺工藝。借助易于理解和模板化的工藝，可以大幅減少時間和資源投入，其中每個分子僅需優(yōu)化少數(shù)參數(shù)。Protein A層析通常是平臺工藝中的首個層析步驟，因為它能夠選擇性地捕獲和濃縮細胞培養(yǎng)物中的產(chǎn)物。然而，對于那些在低pH下容易聚集的復雜蛋白質(zhì)（如某些非典型單克隆抗體），它們可能無法很好地適應(yīng)標準的平臺工藝，從而迫使工藝偏離既定流程，并顯著增加工藝開發(fā)時間。Jetted A50 HipH作為平臺Protein A填料的主要候選者，其優(yōu)勢在于能夠適用于任何含F(xiàn)c的蛋白質(zhì)，無論其對低pH的敏感性如何，并且只需對上樣、洗脫和洗脫階段的緩沖液及體積進行優(yōu)化。溫和的洗脫pH運行條件帶來了更寬廣的操作范圍，但與傳統(tǒng)Protein A填料通常呈現(xiàn)的尖銳且濃縮的洗脫液峰相比，可能會出現(xiàn)洗脫峰拖尾和洗脫液收集量增加的情況。在確定最優(yōu)操作條件時，需要權(quán)衡收率、HMW清除率、天然洗脫液pH和洗脫體積等因素，以實現(xiàn)最佳性能和收率的平衡。相較于使用傳統(tǒng)Protein A填料，這可能會略微增加該Protein A步驟的開發(fā)時間，但從純度角度來看是有益的。Jetted A50 HipH可以輕松替代平臺工藝中現(xiàn)有的Protein A填料，并與現(xiàn)有的下游工藝無縫集成。

Protein A填料（包括Jetted A50 HipH）面臨的主要挑戰(zhàn)之一是其壽命和可清潔性，而填料的高成本使得這一問題更加突出。收率和結(jié)合載量的下降通常歸因于在清潔過程中填料暴露于堿性條件下導致的配基水解，以及雜質(zhì)的積累導致填料污染。本研究未對填料循環(huán)進行評估。供應(yīng)商聲稱，Jetted A50 HipH在暴露于0.1 M氫氧化鈉120小時后仍能保持出色的載量（>85%初始動態(tài)結(jié)合載量，DBC）。這與MabSelect SuRe LX相比要低得多，后者在配基水解研究中，填料在暴露于0.1 M氫氧化鈉約250小時后仍能保持容量（>85%初始DBC）。填料壽命與成本直接相關(guān)，因為填料的成本可以在各個循環(huán)中分攤，填料壽命越短，每個循環(huán)的填料成本就越高。在填料壽命研究中，必須同時評估填料污染和配基水解，以評估在代表性工藝條件下的填料循環(huán)，因為雜質(zhì)可以非特異性地與填料結(jié)合，阻礙與配基的接觸。與僅評估配基水解的研究相比，同時評估污染和配基水解的填料壽命研究觀察到載量和收率下降得更快、更嚴重，這表明與配基水解相比，填料污染在降低結(jié)合載量方面起著更重要的作用。然而，填料污染和配基水解的速率取決于細胞培養(yǎng)基、堿再生溶液和每個循環(huán)的接觸時間。因此，需要對每個分子和填料進行完整的柱循環(huán)研究，以確定在代表性工藝條件下的填料壽命。

結(jié)論

與傳統(tǒng)的Protein A填料Jetted A50和MabSelect SuRe相比，兩種溫和洗脫pH的Protein A填料Jetted A50 HipH和原型HipH-002成功地在較溫和的pH條件下洗脫了6種分子。新商業(yè)化的Jetted A50 HipH填料展現(xiàn)出更廣泛的溫和洗脫特性，大多數(shù)評估的蛋白質(zhì)的洗脫pH達到4.6或更高，預(yù)計能夠在比傳統(tǒng)Protein A填料更溫和的pH下成功洗脫所有含F(xiàn)c的蛋白質(zhì)。HipH填料不僅具有與傳統(tǒng)Protein A填料相當?shù)母呓Y(jié)合載量和回收率，還表現(xiàn)出使用典型清洗去除雜質(zhì)的能力，從而可以無縫集成到傳統(tǒng)的Protein A純化平臺工藝中。對于那些在低pH下不穩(wěn)定而無法使用傳統(tǒng)Protein A層析的蛋白質(zhì)，這項技術(shù)將帶來極大的益處，因為蛋白質(zhì)可以在溫和的pH下洗脫，避免暴露于低pH條件。在溫和pH下洗脫的能力將避免在洗脫緩沖液中使用改性劑或直接中和，從而實現(xiàn)更好的工藝連接和設(shè)備適配，并且所需的生產(chǎn)控制不那么嚴格。對于所有蛋白質(zhì)，即使在低pH下穩(wěn)定，HipH填料也能提供更寬的操作窗口，這可以顯著改善HMW雜質(zhì)的去除，減輕后續(xù)精純步驟的雜質(zhì)負擔。對于那些希望使用熟悉的Protein A工藝，并且能夠靈活地兼容所有含F(xiàn)c蛋白質(zhì)（無論是不穩(wěn)定的還是穩(wěn)定的）的填料的人來說，Jetted A50 HipH是平臺Protein A層析填料的理想選擇。

參考資料：

F.A.S.Wang, Y.Fan, W.K.Chung, et al., Evaluation of mild pH elution protein A resins for antibodies and Fc-fusion proteins. Journal of Chromatography A, 2024.