Nature：閆創(chuàng )業(yè)/袁亞飛團隊揭示去甲腎上腺素轉運蛋白再攝取與抑制的分子基礎

熱門(mén)推薦：去甲腎上腺素 , 多巴胺 , 血清素 ,

來(lái)源：生物世界

2024-07-25

去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）和血清素（5-HT）是重要的單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)，影響著(zhù)包括運動(dòng)、激素分泌、獎懲和情緒相關(guān)的復雜行為和生理過(guò)程。這些神經(jīng)遞質(zhì)在突觸前膜去極化后釋放到突觸間隙，隨后激活突觸后膜上的受體并觸發(fā)影響神經(jīng)元興奮性、突觸可塑性和各種生理過(guò)程的細胞內信號級聯(lián)。正常生理情況下，從突觸前神經(jīng)元釋放的神經(jīng)遞質(zhì)，在完成信號傳導后必須及時(shí)高效地從突觸間隙被清除，從而實(shí)現信號終止。通過(guò)突觸前神經(jīng)元或者神經(jīng)膠質(zhì)細胞質(zhì)膜上的單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)轉運蛋白（MAT），可以將單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)再攝取回突觸前膜從而終止其對下游受體的激活狀態(tài)。目前，MAT家族抑制劑主要在醫藥市場(chǎng)上用作抗抑郁藥，可根據其化學(xué)結構和作用方式分為不同的類(lèi)別（圖1）。

單胺能神經(jīng)元中神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞過(guò)程及不同抗抑郁藥物的作用方式

圖1：?jiǎn)伟纺苌窠?jīng)元中神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞過(guò)程及不同抗抑郁藥物的作用方式

MAT屬于神經(jīng)遞質(zhì)鈉同向轉運蛋白（NSS）家族成員，其利用膜外/內鈉離子Na⁺的濃度梯度來(lái)完成對神經(jīng)遞質(zhì)的同向跨膜運輸，這一過(guò)程可能依賴(lài)于氯離子Cl^-同向轉運以及鉀離子K⁺的反向轉運。近年來(lái)對MAT中底物轉運及抗抑郁藥物調節機制的研究進(jìn)展迅速，其中果蠅多巴胺轉運蛋白dDAT和人源血清素轉運蛋白SERT的不同構象以及與多種抗抑郁藥物分子結合的結構已經(jīng)得到解析。但關(guān)于人源去甲腎上腺素轉運蛋白NET的結構研究相對進(jìn)展緩慢，這大大阻礙了抗抑郁藥物的進(jìn)一步優(yōu)化和開(kāi)發(fā)。

2024年7月24日，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/北京生物結構前沿研究中心閆創(chuàng )業(yè)/袁亞飛團隊在 Nature期刊發(fā)表了題為：Molecular basis of human noradrenaline transporter reuptake and inhibition（人類(lèi)去甲腎上腺素轉運蛋白再攝取與抑制分子基礎）的研究論文。

該研究通過(guò)結構生物學(xué)和生物化學(xué)方法闡明了去甲腎上腺素轉運體（NET）轉運底物去甲腎上腺素（NE）和多巴胺（DA）的機制，首次報道了NET中的第二個(gè)底物結合位點(diǎn)和NSS家族的鉀離子結合位點(diǎn)，揭示了四種不同類(lèi)別的常用上市抗抑郁藥物的選擇性抑制機制，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)靶向單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)轉運蛋白（MAT）的藥物奠定了基礎。

Molecular basis of human noradrenaline transporter reuptake and inhibition（人類(lèi)去甲腎上腺素轉運蛋白再攝取與抑制分子基礎）的研究論文

研究團隊利用冷凍電鏡技術(shù)成功解析了人源NET蛋白的八個(gè)高分辨率結構，包括天然狀態(tài)、結合底物（NE、DA）和四種常用上市抗抑郁藥物（托莫西汀：Atomoxetine，ATX；地昔帕明：Desipramine，DSP；艾司西酞普蘭：Escitalopram，ESC；安非他酮：Bupropion，BPP）的結合狀態(tài)。這些結構是天然蛋白在未使用任何基準標記或突變的情況下獲得，分辨率在2.5到3.5埃之間（圖2）。

圖2：人源NET天然狀態(tài)、結合兩種底物和四種抗抑郁藥物復合物的冷凍電鏡結構

研究發(fā)現，NET中央口袋S1處識別NE或DA的方式與報道的果蠅dDAT不同，其兒茶酚環(huán)上的兩個(gè)羥基主要通過(guò)水介導的氫鍵識別（圖3a，b）。此外，研究在NET與兩種底物結合的結構中都觀(guān)測到了第二個(gè)底物的密度（S2位點(diǎn)）。值得注意的是，與已報道的SERT中的S2位點(diǎn)顯著(zhù)不同，NET中的S2位點(diǎn)位于TM1b C末端，且僅存在于向內閉合或開(kāi)放的構象中，向外開(kāi)放構象轉變會(huì )導致S2位點(diǎn)被破壞（圖3c）。通過(guò)生化實(shí)驗發(fā)現，S2位點(diǎn)內的某些突變顯著(zhù)影響轉運蛋白的轉運速度。推測NET中S2位點(diǎn)的功能可能是提前加載底物，從而加快底物轉運效率。

圖3：NET中心口袋S1的底物結合方式（a-b）、S2位點(diǎn)（c）及K+離子結合位點(diǎn)（d）

MAT成員是離子耦合的膜蛋白，作為次級主動(dòng)轉運蛋白，它們共享兩個(gè)保守的Na⁺結合位點(diǎn)（Na1和Na2）和一個(gè)保守的Cl-結合位點(diǎn)，利用跨膜離子梯度的能量來(lái)催動(dòng)神經(jīng)遞質(zhì)的運輸（圖3a）。早在1979年時(shí)K⁺離子就被提出參與MAT的轉運循環(huán)，但直到現在實(shí)驗結構仍未確定特定的K⁺結合位點(diǎn)。研究團隊在向內開(kāi)口的NET-DSP-KCl結構的Na1位點(diǎn)處發(fā)現了K⁺的額外密度，而該密度在NaCl條件下的NET內向開(kāi)口構象中并不存在。據此，該研究首次通過(guò)結構驗證了NSS家族中K⁺離子的結合位點(diǎn)。這一K⁺離子位點(diǎn)恰好是Na1位點(diǎn)，該位點(diǎn)在向內開(kāi)口釋放Na⁺離子之后，局部殘基構象發(fā)生改變，使得該位點(diǎn)更偏好螯合K⁺離子（圖3d）。盡管確認了Na1處K⁺的存在及其在運輸中的作用，但其觸發(fā)構象轉變的確切機制仍需要進(jìn)一步研究。

深入了解不同抗抑郁藥物對MAT的選擇性抑制的分子基礎對于抗抑郁藥物的開(kāi)發(fā)和應用具有重要意義。托莫西汀是一種NE再攝取抑制劑（NRI），其對NET的選擇性比SERT和DAT高約30倍和130倍；地昔帕明是三環(huán)類(lèi)抗抑郁藥（TCA），其對NET的選擇性比SERT高約20倍；安非他酮是典型的NE和DA再攝取抑制劑（NDRI）；而艾司西酞普蘭是一種典型的選擇性血清素再攝取抑制劑（SSRI），其對SERT的選擇性比NET高約2600倍。

該研究通過(guò)解析四種不同類(lèi)型的抗抑郁藥物的高分辨率結構，為理解其對NET、DAT和SERT選擇性提供了分子基礎。通過(guò)不同抑制劑濃度的[3H]-NE攝取測定，該研究進(jìn)一步揭示了托莫西汀的競爭性抑制及其它三種抑制劑的混合型抑制機制與結合不同構象相關(guān)。這些研究為理解靶向MAT的抗抑郁藥物選擇性提供了重要見(jiàn)解，MAT抗抑郁藥獨特的結合模式和多靶點(diǎn)特性值得制藥行業(yè)特別關(guān)注。

綜上，研究團隊提出了NET的轉運過(guò)程模型（圖4）。在向外開(kāi)放的構象中，Na⁺、Cl^-和底物NE與中央口袋結合，啟動(dòng)NET的閉合，進(jìn)入閉合狀態(tài)。在這個(gè)轉變過(guò)程中，第二個(gè)底物可以提前結合到新形成的膜外S2位點(diǎn)中。隨后，TM1a的打開(kāi)（向內開(kāi)放構象的標志特征）促進(jìn)底物與兩個(gè)Na⁺一起從中央口袋釋放。在轉變回向外開(kāi)放構象的過(guò)程中，S2位點(diǎn)的局部結構將受到破壞，導致S2位點(diǎn)處底物的釋放。釋放的底物可能直接進(jìn)入到中央口袋，開(kāi)始下一個(gè)轉運循環(huán)。這一過(guò)程與兩個(gè)Na⁺離子和一個(gè)Cl^-離子進(jìn)入細胞質(zhì)以及可能一個(gè)K⁺離子進(jìn)入細胞外基質(zhì)的轉運耦合。而不同類(lèi)別的抗抑郁藥物占據S1位點(diǎn)阻礙底物轉運。