Cell：高璞/高光俠/張立國(guó)團(tuán)隊(duì)揭示EB病毒致癌蛋白LMP1的組裝與激活機(jī)制

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2024-07-12

研究發(fā)現(xiàn)，LMP1以一種全新且與此前猜測(cè)完全不同的機(jī)制進(jìn)行寡聚自組裝，并通過(guò)巧妙方式高效招募下游因子，從而激活和維持致病信號(hào)活化。另外，研究中發(fā)現(xiàn)的新機(jī)制和新界面，也為此前一些不清楚的現(xiàn)象提供了精確解釋?zhuān)⒂型苯又MP1靶向干預(yù)策略的開(kāi)發(fā)。

愛(ài)潑斯坦-巴爾病毒（Epstein-Barr Virus，EBV）是一種人類(lèi)皰疹病毒，也是首個(gè)報(bào)道的人類(lèi)腫瘤病毒，全球約95%的成人經(jīng)歷過(guò)感染并終生攜帶EBV。雖然通常不產(chǎn)生嚴(yán)重癥狀，但EBV感染也有幾率導(dǎo)致多種淋巴癌和上皮細(xì)胞癌，如鼻咽癌、霍奇金淋巴癌、伯基特淋巴癌、胃癌等。EBV相關(guān)癌癥約占全球人類(lèi)癌癥負(fù)擔(dān)的1.9%，每年導(dǎo)致約35萬(wàn)新增癌癥病例，對(duì)人類(lèi)生命健康產(chǎn)生巨大威脅。

潛伏期膜蛋白1（Latent Membrane Protein 1，LMP1）是EBV編碼的關(guān)鍵致癌蛋白。1985年，Elliott Kieff團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道LMP1單一蛋白表達(dá)即能誘發(fā)B細(xì)胞的永生化，后續(xù)研究也相繼發(fā)現(xiàn)LMP1通過(guò)模擬CD40信號(hào)參與B細(xì)胞和上皮細(xì)胞增殖和早期癌變。而與CD40不同，LMP1信號(hào)的激活不依賴(lài)任何配體，且LMP1介導(dǎo)的信號(hào)強(qiáng)度顯著強(qiáng)于CD40。除了介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和永生化，LMP1還參與調(diào)控多種重要生命活動(dòng)，包括免疫應(yīng)答（如核酸免疫通路、干擾素通路、細(xì)胞免疫等）、細(xì)胞因子和趨化因子分泌、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移、細(xì)胞互作、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等。鑒于LMP1與EBV致病的高度關(guān)聯(lián)性，以及LMP1在EBV相關(guān)惡性腫瘤中的廣泛表達(dá)和分布，LMP1一直被認(rèn)為是EBV陽(yáng)性腫瘤鑒別診斷和靶向治療的理想靶點(diǎn)。

盡管目前對(duì)LMP1介導(dǎo)的下游功能有了較多認(rèn)識(shí)，然而作為產(chǎn)生多樣性功能的核心前提——即LMP1如何實(shí)現(xiàn)配體不依賴(lài)的組裝和激活，仍然是困擾領(lǐng)域近40年的難題，也是影響LMP1靶向干預(yù)策略成功開(kāi)發(fā)的重要阻礙。

2024年7月11日，中國(guó)科學(xué)院生物物理所高璞、高光俠、張立國(guó)合作團(tuán)隊(duì)在 Cell 期刊發(fā)表了題為：Assembly and activation of EBV latent membrane protein 1 的研究論文，該團(tuán)隊(duì)經(jīng)過(guò)6年多的科研攻關(guān)，揭開(kāi)了EBV關(guān)鍵致癌蛋白LMP1自組裝和組成性激活的神秘面紗。

該研究發(fā)現(xiàn)，LMP1以一種全新且與此前猜測(cè)完全不同的機(jī)制進(jìn)行寡聚自組裝，并通過(guò)巧妙方式高效招募下游因子，從而激活和維持致病信號(hào)活化。另外，研究中發(fā)現(xiàn)的新機(jī)制和新界面，也為此前一些不清楚的現(xiàn)象提供了精確解釋?zhuān)⒂型苯又MP1靶向干預(yù)策略的開(kāi)發(fā)。

Assembly and activation of EBV latent membrane protein 1 研究論文

研究團(tuán)隊(duì)首先利用共聚焦顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞成像，發(fā)現(xiàn)LMP1在生理表達(dá)水平下會(huì)在膜上呈現(xiàn)為明顯的聚集形態(tài)。進(jìn)一步的超分辨成像表明，LMP1的聚集是一種寬度較為固定但長(zhǎng)度不均一的細(xì)條狀結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果表明LMP1可在膜上組裝成有趣的聚集，但其分子層面的細(xì)節(jié)仍不清楚。

為回答這一問(wèn)題，研究團(tuán)隊(duì)計(jì)劃解析LMP1在不同組裝狀態(tài)下的精細(xì)結(jié)構(gòu)。然而，這一目標(biāo)在過(guò)去近40年的研究中已被證明非常具有挑戰(zhàn)性，主要是因?yàn)椋?）性質(zhì)良好的LMP1蛋白很難大量制備；2）LMP1核心跨膜區(qū)僅~20 KDa，且?guī)缀鯚o(wú)可識(shí)別的穩(wěn)定水溶區(qū)。

經(jīng)過(guò)大量嘗試，研究團(tuán)隊(duì)解決了LMP1難表達(dá)、難純化的問(wèn)題，生化分析也提示LMP1在溶液中存在不同聚集狀態(tài)。為輔助結(jié)構(gòu)解析，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步開(kāi)展了系統(tǒng)性L(fǎng)MP1抗體篩選，獲得了能夠穩(wěn)定結(jié)合LMP1跨膜區(qū)的鼠源單抗。通過(guò)抗體輔助策略，研究團(tuán)隊(duì)成功解析了LMP1兩種意想不到的聚集態(tài)結(jié)構(gòu)：軸對(duì)稱(chēng)二聚體和filament狀高聚體。LMP1單體以一種全新的方式進(jìn)行跨膜區(qū)折疊，進(jìn)而通過(guò)反向平行疊合形成穩(wěn)定的二聚體結(jié)構(gòu)；LMP1二聚體是其進(jìn)行更高級(jí)組裝的基本單元，多個(gè)二聚體以“side-by-side”方式自組裝形成filament狀高聚結(jié)構(gòu)。重要的是，這些高分辨率的結(jié)構(gòu)信息，恰好符合活細(xì)胞成像所觀(guān)測(cè)到的獨(dú)特聚集形態(tài)，從而在不同分辨率尺度上揭示了LMP1的膜上聚集機(jī)制。

值得一提的是，由于目前PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中尚無(wú)任何LMP1的同源結(jié)構(gòu)，LMP1多種狀態(tài)（單體、二體及寡聚體）的真實(shí)結(jié)構(gòu)均與AlphaFold2/3等工具的預(yù)測(cè)結(jié)果完全不同。而且，這種不同不僅體現(xiàn)在結(jié)構(gòu)折疊的巨大差異，更為嚴(yán)重的是預(yù)測(cè)結(jié)果的基本拓?fù)鋵W(xué)走向也完全錯(cuò)誤。這提示在沒(méi)有同源結(jié)構(gòu)訓(xùn)練的情況下，我們對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)的使用需格外謹(jǐn)慎。從另一個(gè)角度來(lái)說(shuō)，該研究中獲得的LMP1多種聚集狀態(tài)的真實(shí)結(jié)構(gòu)，也為后續(xù)預(yù)測(cè)訓(xùn)練提供了全新且獨(dú)立的折疊方式及組裝模式。

LMP1在膜上的組裝和聚集

為進(jìn)一步明確LMP1的功能形式，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)二聚體和寡聚體界面分別進(jìn)行了系統(tǒng)突變，發(fā)現(xiàn)其均會(huì)破壞LMP1在活細(xì)胞中的膜聚集形態(tài)，且均能阻斷下游信號(hào)通路活化。這既證明了LMP1分子間互作的重要性，也明確了LMP1的寡聚filament結(jié)構(gòu)才是其真正的激活狀態(tài)。超分辨成像結(jié)果表明，LMP1在膜上的自發(fā)filament狀聚集可包含幾十至數(shù)百個(gè)LMP1二聚體單元。LMP1的這種聚集在很低蛋白水平下即可發(fā)生，且隨著LMP1含量增加，多聚體的數(shù)量、強(qiáng)度和長(zhǎng)度均呈現(xiàn)顯著增長(zhǎng)。這也是首次在較低表達(dá)水平下（類(lèi)似病毒感染的表達(dá)水平），系統(tǒng)性觀(guān)察到LMP1在膜上的超分辨動(dòng)態(tài)聚集和組裝。

有趣的是，作為L(zhǎng)MP1的功能相關(guān)蛋白，宿主膜受體CD40的激活需依賴(lài)其配體介導(dǎo)的三聚體組裝；而且，LMP1和CD40共同的下游信號(hào)因子TRAF蛋白，也是以三聚體形式發(fā)揮功能。因此，長(zhǎng)期以來(lái)領(lǐng)域里普遍推測(cè)LMP1也應(yīng)該是采用三聚體的方式來(lái)組裝，這樣才能更好的與下游因子進(jìn)行銜接。而LMP1卻是以二聚體為單元進(jìn)行“side-by-side”方式的filament自組裝，那么其是如何有效協(xié)調(diào)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的呢？

研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)細(xì)致分析，發(fā)現(xiàn)二聚體單元中的兩個(gè)LMP1的C端，可以和鄰近二聚體中一個(gè)LMP1的C端，在空間上呈現(xiàn)近似等邊三角行的巧妙排列。由于C端延伸的水溶區(qū)負(fù)責(zé)招募下游因子，因此這種filament自組裝方式，結(jié)構(gòu)上等價(jià)于多個(gè)LMP1“三聚體”平行密集排列，從而能夠比CD40更高效招募下游因子和進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。此前研究也證實(shí)，如果將CD40 負(fù)責(zé)下游因子招募的C端水溶區(qū)連接到LMP1的跨膜區(qū)上，那么這種嵌合體蛋白的信號(hào)激活能力要顯著強(qiáng)于原始的CD40。同時(shí)，研究團(tuán)隊(duì)也通過(guò)生化手段在體外重組了LMP1與TRAF復(fù)合體，利用電鏡直接觀(guān)察到LMP1的filament聚集確實(shí)可以同時(shí)招募多對(duì)TRAF三聚體。LMP1這種多位點(diǎn)且組成性的下游蛋白招募、激活方式，極大促進(jìn)了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)強(qiáng)度，并有效維系了持續(xù)的增殖、癌變信號(hào)。