藥物的半衰期決定了它在體內的停留時(shí)間。短的半衰期可以通過(guò)給藥間隔和劑量來(lái)補償，但在成本和安全性方面存在限制。那些獲得了監管批準的多肽藥物，為我們提供了將肽穩定性從幾分鐘提高到幾小時(shí)甚至更長(cháng)時(shí)間的成功案例。與內源性肽相比，批準的肽治療藥物的血漿半衰期顯著(zhù)提高。
多肽化學(xué)使用不同的改性策略，來(lái)延長(cháng)肽治療劑的穩定性。通過(guò)使用這些化學(xué)修飾來(lái)穩定生物活性肽，緩解血液或組織蛋白酶介導的降解和失活，從而增強多肽候選藥的類(lèi)藥性。
01
N端乙酰化
圖片圖1. 多肽N端乙酰化與C端酰胺化
多肽N端乙酰化是最常見(jiàn)的多肽化學(xué)改性增加穩定性的手段之一。值得注意的是，截至2021年底，62個(gè)（不包括已撤消的羅穆?tīng)栯暮桶舶湍就。┮焉鲜械亩屉模ㄓ尚∮诨虻扔?5個(gè)氨基酸殘基組成）中，有37個(gè)實(shí)體在其N(xiāo)端通過(guò)酰化、焦谷氨酸或環(huán)化的方式得以封閉。在Nα沒(méi)有封閉的多肽藥物中，有11個(gè)為含二硫鍵的環(huán)肽和1個(gè)酰胺化環(huán)肽，還有一個(gè)為prodrug。從分析數據來(lái)看，截止2021年底FDA批準的短肽藥物中，只有9種線(xiàn)性肽實(shí)際上具有自由Nα基團。
多肽N端封閉，除了避免外肽酶（Exopeptidase，或稱(chēng)“肽鏈端解酶”）的酶解作用之外，防止多肽以DKP (diketopiperazine，二酮哌嗪）的方式化學(xué)降解，也是一個(gè)重要的原因。擁有自由Nα基團的多肽肽鏈，可以在堿性至中性條件下通過(guò)DKP的方式進(jìn)行降解，產(chǎn)生一個(gè)六元環(huán)2，5-二酮哌嗪，以及相應的缺失N-端二肽的縮短的肽鏈 (圖2)[1]。
DKP是多肽合成、純化、制劑和存儲過(guò)程中，常見(jiàn)的降解類(lèi)型之一。為了防止外肽酶的酶促降級，以及DKP化學(xué)降解，多肽藥物尤其是較小尺寸的多肽藥物，通常借助N端乙酰化封閉的方式。
圖2. 多肽DKP降解機理
類(lèi)似的是，在多肽C端可以使用酰胺化，將多肽C端天然的羧酸基團轉化為相應的酰胺基團，降低carboxypeptidase（羧肽酶）對于多肽C端某些特定的氨基酸的酶解（例如：羧肽酶A裂解C端的Phe、Tyr、Trp或Leu；羧肽酶B裂解C端的Lys或Arg）。若將這些C端氨基酸替換為相應的氨基酸酰胺，羧肽酶的酶解作用或將顯著(zhù)降低。
02
多肽環(huán)化
圖3. 多肽環(huán)化模式示意圖
多肽環(huán)化是常見(jiàn)的多肽改性，它不僅同時(shí)消除了多肽N端和C端易遭受外肽酶降解的氨基和羧基，而且可以將多肽的構型保持在利于與受體結合的狀態(tài)，從而大大提高這些多肽的生物學(xué)活性。最新獲得FDA監管批準的新藥，治療念珠菌血癥和侵襲性念珠菌病的棘白菌素多肽類(lèi)似物——Rezafungin（圖4），就是一款環(huán)肽藥物。
圖4. Rezafungin化學(xué)結構
常見(jiàn)的多肽環(huán)化方式包括：
頭對尾酰胺環(huán)化
頭對側鏈酰胺環(huán)化
尾對側鏈酰胺環(huán)化
側鏈對側鏈酰胺環(huán)化
二硫鍵環(huán)化
硫醚鍵環(huán)化
三唑環(huán)化
乙烯鍵環(huán)化
03
D-氨基酸替換
D-氨基酸替換也是一種常見(jiàn)的增加多肽藥物穩定性的手段，可以降低空間構象依賴(lài)的酶水解。由于核糖體對L-氨基酸具有特異性，因此D-肽很少天然存在于生物體中，不易被消化或降解。D肽模擬肽是設計用于模擬通常具有治療特性的天然L肽的D肽。D-氨基酸多肽尤其在多肽抗生素的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，發(fā)揮著(zhù)重要的作用[2]。
04
N-甲基化多肽
N-甲基化多肽，不僅可以增加多肽的化學(xué)穩定性，降低內肽酶的酶促降解，而且對于多肽的空間結構也產(chǎn)生極為關(guān)鍵的作用。通過(guò)N-甲基化，受影響的酰胺鍵不再成為H-鍵供體，這將對多肽的二級結構影響深遠。N-甲基化也因此成為即Alanine scan, D-amino acid scan之后，最常為藥物化學(xué)家使用的多肽篩選工具。
著(zhù)名的N-甲基化多肽上市藥物，包括環(huán)孢素cyclosporine A（圖5）等，其結構中包含7個(gè)N-甲基氨基酸，不僅大大提高了環(huán)孢素的水解穩定性，也為它的空間結構形成了幾乎無(wú)法復制的精妙調節，使得環(huán)孢素成為第一款實(shí)現口服遞送的多肽藥物。
圖5. Cyclosporine A化學(xué)結構
05
脂化修飾
脂化修飾（lipidation）通常可以減少一個(gè)多肽的正電荷（被修飾的氨基酸通常是賴(lài)氨酸）。但更關(guān)鍵的是，引入的脂質(zhì)結構大大增加了多肽的半衰期，這通常被認為是通過(guò)增加與白蛋白（albumin）的結合而實(shí)現的。
在這方面最著(zhù)名的例子來(lái)自于GLP-1多肽類(lèi)似物，治療2型糖尿病和肥胖癥的司美格魯肽，以及同為2型糖尿病多肽藥物的GLP-1/GIP受體雙重激動(dòng)劑替爾泊肽（圖6）。司美格魯肽更是在使用滲透增強劑（permeation enhancer）SNAC的基礎上，實(shí)現了口服制劑（Rybelsus?）的開(kāi)發(fā)與上市。
關(guān)于脂化修飾這塊內容，哥哈骎老師之前的文章中也有詳細闡述，文章傳送門(mén)：“當紅炸子雞”司美格魯肽、替爾泊肽的背后，脂質(zhì)化修飾助力多肽藥物口服遞送。
圖6. 脂化多肽司美格魯肽與替爾泊肽化學(xué)結構
06
細胞遞送多肽
雖然絕大多數多肽靶向細胞外蛋白，但為了到達細胞內目標受體，多肽需要穿過(guò)細胞膜。然而，肽通常只能有限地穿越這種生物屏障。為了定制用于細胞內遞送的肽，與細胞穿透肽（CPPs, Cell-Penetrating Peptides）序列的綴合，使得將生物活性肽遞送至細胞內靶標成為了可能。研究中使用了幾種細胞穿透肽，例如penetratin、聚精氨酸、轉運蛋白和TAT (trans-activator of transcription, 轉錄反式激活因子) 肽[3]。
07
分子接枝 (Molecular grafting)
圖7. 多肽分子接枝示意圖，來(lái)源：Drug Discovery Today
分子接枝是多肽藥物開(kāi)發(fā)和新型探針設計的一個(gè)有前途的趨勢。該方法用于設計具有類(lèi)藥物特性的肽療法。構象受限和高度穩定的肽在這個(gè)策略中被用作支架，與生物活性表位“融合”，產(chǎn)生所謂的分子接枝[4]。在合成探針并驗證其構象完整性后，根據其生物活性選擇接枝肽。所得分子結合了肽支架提供的穩定性增加、以及生物活性表位提供的功能化的優(yōu)點(diǎn)。
研發(fā)人員已針對此應用探索了幾種自然衍生的肽，包括環(huán)狀半胱氨酸結肽（knot peptide）[5]、套索肽（lasso peptide）[6]、環(huán)狀向日葵胰蛋白酶抑制劑1[7]和θ-防御素[8]。該方法用于制備靶向GPCR、整合素、離子通道和其他細胞表面受體的新探針，包括血管內皮 生長(cháng)因子受體 (VEGFR)、 酶或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。
線(xiàn)性抗血管生成肽P15，在人血清中2小時(shí)內分解。如果使用分子接枝策略，將P15序列整合到主鏈環(huán)化胰蛋白酶抑制肽——Momordica cochinchinensis胰蛋白酶抑制劑-II (MCoTI-II) 中，不僅顯著(zhù)提高P15穩定性至8h，而且改善了對人臍靜脈內皮細胞細胞遷移的抑制特性[9]。
人血小板反應蛋白-1（TSP1）是血管生成的內源性抑制劑。來(lái)自血小板反應蛋白序列的生物活性七肽，通過(guò)與清道夫受體CD36相互作用抑制血管生成。然而，TSP1在人血清中會(huì )在4小時(shí)內降解。在MCoTI-II或向日葵胰蛋白酶抑制劑1支架中“嫁接”生物活性七肽，不僅顯著(zhù)提高了肽在24小時(shí)內的穩定性，而且還增加了其抑制人臍靜脈內皮細胞細胞遷移的活性[10]。
分子接枝技術(shù)將豐富多肽藥物開(kāi)發(fā)的可使用工具，利用這種方法有可能在未來(lái)開(kāi)發(fā)出更多有價(jià)值的多肽藥物。
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