細胞凋亡抑制蛋白（IAP，Inhibitor of Apoptosis）是功能上和結構上相關的蛋白質家族，其作為程序性細胞死亡（細胞凋亡）的內源性抑制劑。

       IAP是細胞凋亡和促存活信號通路的重要調節(jié)因子，其失調通常與腫瘤發(fā)生和生長息息相關。

       IAP抑制劑可分為Smac模擬物和非肽類小分子兩類。目前，全球尚無IAP抑制劑獲批上市，IAP不僅可以作為藥物靶標，也可以作為E3連接酶設計特異性和非遺傳IAP依賴性蛋白消除劑SNIPERs降解靶標蛋白，還可以連接其它E3連接酶配體合成異型雙功能降解劑。

       IAP結構與功能

       細胞凋亡或程序性死亡是一種天然的細胞周期過程，旨在消除體內不需要或受損的細胞。在健康組織中，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白間存在良好的調節(jié)平衡，二者共同作用調控細胞凋亡。但是，癌細胞通過上調抗凋亡蛋白的表達，抑制細胞凋亡，最終導致腫瘤的生長、預后不良和耐藥性等問題。

       IAP通過多種機制，在調節(jié)細胞死亡過程中發(fā)揮關鍵作用。

       哺乳動物IAP家族中有八個成員：細胞IAP1（c-IAP1）、X染色體連接IAP（XIAP）、細胞IAP2（c-IAP2）、神經元IAP（NAIP）、泛素結合BIR結構域酶（BRUCE）、存活蛋白、IAP樣蛋白2（ILP2）和黑色素瘤IAP（ML-IAP）[1]。

       IAP由三個BIR結構域（BIR1至BIR3）、一個泛素相關（UBA）結構域和一個C末端RING結構域組成。cIAP1/2還包含一個CARD域（圖1）[2,3]。

       圖1. IAP蛋白的結構域組織

       XIAP是唯一直接與半胱天冬酶3/7結合并抑制其活性的IAP（圖2A）。Smac/Diablo和SM涉及不同細胞途徑的靶向同源IAPs。半胱天冬酶/IAP直接結合第二線粒體衍生的半胱天冬酶激活劑（Smac/Diablo），激發(fā)了大量化合物的設計和合成，稱為Smac模擬物（SMs）。

       XIAP抑制劑（半胱天冬酶-9，綠色表面）和效應半胱天冬酶（半胱天冬酶-3和-7，洋紅色表面），與 II 類BIR（分別為BIR3和BIR2）相互作用。

       特別是，II型BIR顯示為一個保守的IBM凹槽（藍色縮放視圖中的區(qū)域），其中包含在球體中報告的N端IAP結合基序（IBM）。Smac/Diablo在壓力刺激下從線粒體釋放，取代通過暴露N末端四肽Ala-Val-Pro-Ile（AVPI）（橙色球體）的半胱天冬酶，這是SM的設計基礎。圖2B顯示cIAPs作為無活性單體存在于細胞質中[3]。

       圖2. Smac/Diablo和SM涉及不同細胞途徑的靶向同源IAPs

       治療誘導cIAP1/2的二聚化和快速自泛素化，可以導致其降解。除了對半胱天冬酶的抑制作用外，IAPs還參與腫瘤壞死因子-α（TNFα）誘導的細胞死亡信號傳導。

       IAP拮抗劑

       最初研究者開發(fā)了一種IAP拮抗劑，靈感來自于AVPI肽，稱為第二線粒體衍生的半胱天冬酶激活劑（SMAC）的N末端序列。SMAC干擾XIAP與半胱天冬酶-9相互作用，抑制細胞凋亡。SMAC與cIAP1/2相互作用，并誘導構象變化，導致自我泛素化和自我分解。

       這些結果表明，cIAP1/XIAP的雙重拮抗劑可通過外源性和內源性途徑，促進細胞凋亡。早期擬肽IAP拮抗劑已從單價形式演變?yōu)槎r形式，以最大限度地提高其功效（圖3）[4]。

       近期，Astex Pharmaceuticals推出了第一個非肽型IAP拮抗劑，稱為tolinapant，目前作為晚期實體瘤和淋巴瘤的靶標進行臨床試驗（圖3，NCT02503423），加強了IAP作為抗癌治療靶點的重要性[5]。

       圖3. 近期開發(fā)的第二種線粒體衍生的半胱天冬酶激活劑（SMAC）的凋亡蛋白（IAP）拮抗劑的模擬抑制劑

       E3連接酶

       E3連接酶可以分成RING、HECT、RBR等家族，每個家族下又有其他分型。目前已知的E3連接酶約有600多種，但在PROTAC中常用配體的相關E3連接酶只有 CRBN、VHL、IAP、MDM2等四種（圖4），此外還有DCF15、RNF114、DCAF16、KEAP1、FEM1B等僅有少數(shù)配體報導的E3連接酶。

       圖4. 常見的E3連接酶配體

       除此之外，也已開發(fā)出了很多新型結構E3連接酶配體，如圖5所示新型CRBN配體[6]。

       圖5. 新型CRBN配體

       近些年來，人們也在開發(fā)不同的E3連接酶用于PROTAC設計。如2021年，Ishida等人專注于發(fā)現(xiàn)用于PROTAC的新型E3泛素連接酶的新方法。這些方法包括分子建模方法，例如基于晶體學數(shù)據(jù)收集信息的SBDD和FBDD方法、基于活性的蛋白質分析（ABPP）篩查或表型篩查。通過這些方法，他們發(fā)現(xiàn)一些可以用于PROTACs設計的E3連接酶（圖6）[6]。

       圖6. 尚未探索用于PROTAC應用的E3泛素連接酶列表

       基于IAP設計的SNIPERs

       基于IAP抑制劑可以設計SNIPERs，SNIPERs與PROTAC相似，可以招募E3連接酶來降解靶標蛋白，只是用的E3連接酶配體是IAP抑制劑。

       烏苯美司（BS）及其衍生物，顯示出與IAP的BIR3結構域的結合活性，因此誘導自我泛素化的蛋白酶體降解，或者使其它蛋白泛素化從而被降解。

       由于IAP具有如此高的親和力，人們可以基于BS結構衍生得到SNIPERs（如圖7A所示）。Natio等人報道，甲基烏苯美司（MeBS）可以增強癌細胞對癌癥藥物誘導的細胞凋亡的化學敏感性，從而促進細胞凋亡[7]。

       機理研究揭示，MeBS誘導RING依賴性自身泛素化和通過與cIAP1的第三個BIR域結合，誘導cIAP1蛋白酶體降解（如圖7B所示）。SAR研究表明，即使用更龐大的基團取代羧酸甲酯，cIAP1水平仍能保持降低，表明MeBS的羧酸甲酯基團沒有與cIAP1形成相互作用。這些結果促使Natio等人擴展分子框架以設計SNIPER，從甲基的位置連接接頭，該接頭進一步連接到對靶蛋白具有內在活性的分子上，如圖7C所示。

       圖7.（A）烏苯美司及其衍生物的分子結構；（B）報道的cIAP降解機制；（C） SNIPERs作用機制

       除了烏苯美司及其衍生物之外，化合物1（圖3）也被選為開發(fā)降解劑的IAP抑制劑，因為它是現(xiàn)有二價IAP拮抗劑的一部分（圖3），如化合物20通過泛素蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）招募IAP來降解RIPK2（圖8）[8]。

       圖8. 基于IAP設計的PIPK2的PROTAC

       異型雙功能泛IAP降解劑

       E3連接酶不僅可以被用來設計PROTACs或SNIPERs，也可以作為靶標蛋白被降解，之前也已經有很多異型雙功能降解劑被報道，如連接CRBN配體和VHL配體招募E3連接酶VHL，來降解CRBN蛋白的降解劑CRBN-6-5-5-VHL，或連接MDM2配體和CRBN配體招募E3連接酶CRBN，來降解MDM2蛋白的降解劑MD-224等（圖9）[9]。

       圖9. 異型雙功能E3連接酶降解劑

       近期，Seulki等人在EJMC上報道了一類異型雙功能泛IAP降解劑，他們合成了十幾個化合物，并評估它們在MCF-7細胞中對cIAP1、cIAP2和XIAP的降解作用，最終發(fā)現(xiàn)化合物12（圖10）在0.1 mM和1 mM濃度時，對cIAP1、cIAP2和XIAP都有超過95%的降解（除了在0.1 mM對cIAP1有87%的降解）[4]。

       圖10. 化合物12（TD-1092）的結構和降解活性

       而且，Yuen在JMC也發(fā)表了連接IAP配體和VHL配體或者CRBN配體，來設計異型雙功能泛IAP降解劑（圖11）[9]。

       圖11. 異型雙功能E3連接酶降解劑

       他們設計了三種不同系列的異型雙功能降解劑，其中兩種與VHL配體不同位置連接而得，另一種與CRBN配體連接，從圖12可以看出大部分化合物對三種IAP蛋白有很明顯的降解功能。

       圖12. 三種不同類型的異型雙功能降解劑

       他們最終發(fā)現(xiàn)化合物9對三種IAP蛋白（cIAP1、cIAP2和XIAP）都有很明顯的降解作用，而且它對多種細胞系有很明顯的抑制生長作用（圖13）。

       圖13. 化合物9的結構與活性

       小結

       細胞凋亡或程序性死亡是一種天然的細胞周期過程，旨在消除體內不需要或受損的細胞。在健康組織中，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白間存在良好的調節(jié)平衡，二者共同作用調控細胞凋亡。但是，癌細胞通過上調抗凋亡蛋白的表達，抑制細胞凋亡，最終導致腫瘤的生長、預后不良和耐藥性等問題。

       據(jù)預測到2030年，細胞凋亡市場規(guī)模有望達到36.3億美元，2022-2030年復合增長率達31.7%。

       細胞凋亡抑制蛋白是功能上和結構上相關的蛋白質家族，其作為程序性細胞死亡（細胞凋亡）的內源性抑制劑。IAP可直接結合含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase），抑制Caspase的活性，預防細胞凋亡。

       IAP抑制劑可分為Smac模擬物和非肽類小分子兩類，其中Smac模擬物可依據(jù)結合位點的數(shù)目分為單體和二聚體抑制劑，包括LCL161、AT-406等；二聚體抑制劑可激活Caspase-3/7/9的活性，達到促進細胞凋亡的目的，包括APG-1387等。

       目前全球尚無IAP抑制劑獲批上市，IAP不僅可以作為藥物靶標，也可以作為E3連接酶設計SNIPERs降解靶標蛋白（化合物20通過UPS系統(tǒng)招募IAP來降解RIPK2），而且還可以連接其它E3連接酶配體合成異型雙功能降解劑（如異型雙功能泛IAP降解劑9和12）。

       參考資料：

       1.Deveraux, Q.L.; Reed, J.C. IAP family proteins—Suppressors of apoptosis. Genes Dev. 1999, 13, 239–252.

       2.P. Mace, S. Shirley, C. Day, Assembling the building blocks: structure and function of inhibitor of apoptosis proteins, Cell Death Differ. 17 (2010) 46–53.

       3.F. Cossu, M. Milani, E. Mastrangelo, D. Lecis, Targeting the BIR domains of inhibitor of apoptosis (IAP) proteins in cancer treatment, Comput. Struct. Biotechnol. J. 17 (2019) 142–150.

       4.Seulki Park, Dayoung Kim, Woori Lee, Jin Hwa Cho, Sungyoung Kim, Ga Seul Lee, Jeong Hee Moon, Jung-Ae Kim, Jae Du Ha, Jeong-Hoon Kim, Hyun Jin Kim, Discovery of pan-IAP degraders via a CRBN recruiting mechanism, European Journal of Medicinal Chemistry 245 (2023) 114910.

       5.N. Crawford, K.J. Stott, T. Sessler, C. McCann, W. McDaid, A. Lees, C. Latimer, J. P. Fox, J.M. Munck, T. Smyth, Clinical positioning of the IAP antagonist tolinapant (ASTX660) in colorectal cancer, Mol. Cancer Therapeut. 20 (2021) 1627–1639.

       6.Nicolas Guedeney, Marie Cornu, Florian Schwalen, Charline Kieffer, Anne Sophie Voisin-Chiret, PROTAC technology: A new drug design for chemical biology with many challenges in drug discovery, Drug Discovery Today, Volume 28, Number 1 January 2023.

       7.Arvind Negi, Kavindra Kumar Kesari, and Anne Sophie Voisin-Chiret, Estrogen Receptor-_ Targeting: PROTACs, SNIPERs, Peptide-PROTACs, Antibody Conjugated PROTACs and SNIPERs, Pharmaceutics 2022, 14, 2523.

       8.A.H. Miah, I.E. Smith, M. Rackham, A. Mares, A.R. Thawani, R. Nagilla, P.A. Haile, B.J. Votta, L.J. Gordon, G. Watt, Optimization of a series of RIPK2 PROTACs, J. Med. Chem. 64 (2021) 12978–13003.

       9.Yuen Lam Dora Ng, Alesa Bricelj, Jacqueline A. Jansen, Arunima Murgai, Kirsten Peter, Katherine A. Donovan, Michael Gutschow, Jan Kronke, Christian Steinebach, and Izidor Sosic, Heterobifunctional Ligase Recruiters Enable pan-Degradation of Inhibitor of Apoptosis Proteins, J Med Chem. 2023 Mar 30.