腫瘤抑制蛋白p53是一種轉錄因子，在調節細胞周期進(jìn)展和細胞死亡中起著(zhù)關(guān)鍵作用——P53誘導其自身抑制劑（人類(lèi)雙微體-2、HDM2）的轉錄。
HDM2與p53結合，抑制其轉錄活性，將p53蛋白引進(jìn)細胞質(zhì)，并通過(guò)E3泛素途徑將其靶向蛋白酶體降解。
HDM2通過(guò)三種機制抑制p53活性：
1）充當E3泛素連接酶以促進(jìn)p53降解；
2）結合并阻斷p53轉錄活化結構域；
3）將p53從細胞核輸出到細胞質(zhì)。
在某些類(lèi)型的癌癥（骨肉瘤、軟組織、肺癌和腦瘤等）中已經(jīng)觀(guān)察到，HDM2的過(guò)表達使P53失活。HDM2-p53蛋白-蛋白相互作用的中斷(PPI)能解除p53的負調控，使其發(fā)揮抗增殖和促凋亡功能。因此，使用HDM2?p53 PPI抑制劑已經(jīng)成為治療人癌癥（WT p53）的一種有吸引力的方法。
每一篇JMC中的Drug Annotation都是一個(gè)新藥開(kāi)發(fā)的小故事，本篇文章想分享一下默克公司的MK4688的改造故事。
兩種蛋白接觸的表面具有large, flat的疏水界面，使得蛋白蛋白抑制劑與經(jīng)典的口服藥物相比具有分子量更大、更親脂的特點(diǎn)，這類(lèi)分子特性導致臨床需要高劑量和PK具有可變異性，從而降低了分子最終成藥的可能性。
圖1 幾類(lèi)不同骨架的HDM2抑制劑及其理化性質(zhì)、活性和臨床進(jìn)展
HDM2與p53的相互作用主要是通過(guò)疏水界面介導的，其中位于p53的N端α螺旋上的Phe19、Trp23和Leu26殘基與HDM2蛋白表面的疏水口袋產(chǎn)生相互作用。
盡管PPI界面具有這一特點(diǎn)，仍有一些HDM2抑制劑進(jìn)入了臨床開(kāi)發(fā)中，圖1這些抑制劑都具有一些特點(diǎn)：高親脂性（Clogp較大）、高分子量(MW)、需要高劑量才能達到臨床需要的有效性。
在一期臨床中的AML(急性髓系白血病)試驗，RG7112顯示了可變異性的暴露，在MTD劑量(1500 mg，BID)下，只有37%的患者達到了實(shí)現有效性所需要的最小暴露量。因此，提高HDM2抑制劑的類(lèi)藥性非常重要。
第二代的RG7388, SAR405838, AMG232完善了分子的理化性質(zhì)，目前處于臨床研究階段。MK-8242分子具有高M(jìn)W，高clogp，較高的推薦劑量（2期劑量為每天0.8 g）；默克公司最初通過(guò)高通量篩選新的骨架分子以期望得到分子量低、劑量也低的HDM2-P53抑制劑。
圖2 hit的優(yōu)化過(guò)程及2和HDM2蛋白的共晶 (PDB 7NA1)
通過(guò)高通量篩選得到化合物1，這是一個(gè)分子量低、帶嘌呤骨架的小分子化合物，對hit的優(yōu)化集中在嘌呤母核的C6、N7和C8上，環(huán)己亞甲基替換為對氯芐基、間苯基改為苯并噻吩、NH的α位碳引入手性甲基；最終活性提高了30倍，并提高了LBE（配體結合效率）；通過(guò)觀(guān)察化合物2和HDM2蛋白的X-ray晶體結構，2的嘌呤骨架具有α螺旋的特征，高效的將取代基伸入3個(gè)已報道過(guò)的HDM2蛋白表面的hot spot結合口袋中，C6烷基胺占據Leu26口袋，N7的芐基填充Trp23口袋，C8苯并噻吩占據了Phe19口袋。C2羧酸與HDM2的His96側鏈發(fā)生關(guān)鍵的靜電相互作用，類(lèi)似于A(yíng)MG232的羧酸取代基的作用。
默克公司的優(yōu)化策略是在盡量不增加分子量的基礎上提高活性、提高成藥性。
圖3 取代基團優(yōu)化過(guò)程
根據圖2的共晶，羧酸位于His96口袋、苯并噻唑在Phe19口袋、氯苯在Trp23口袋、環(huán)丙甲基在Leu26口袋；從圖3看出，先導2中的環(huán)丙基改為環(huán)丁基、氯芐基改為三氟甲基芐基提高了與leu26和Trp23的疏水接觸，觀(guān)察Phe19口袋的空腔可以減小取代基團的大小，得到的化合物23，活性提高了17倍；最終把紅色片段優(yōu)化到苯環(huán)手性取代的嗎啉環(huán)得到化合物27，活性達到1.8 nM;根據NMR-based模型，藍色區域的Trp23口袋更適合飽和脂肪環(huán)占據，且引入了手性發(fā)現化合物33，活性達到2.2 nM，把27和33的最優(yōu)取代片段整合到一塊得到了化合物15，活性達到0.2 nM.
圖4 C2位羧酸的生物電子等排改造
在取得了優(yōu)異的TR-FRET的 IC50活性后，化合物15的細胞活性BLA IC50只有1.1μmoL，降低了5500倍，這種情況很可能是因為嘌呤羧酸部分（計算pKa為2.1）的高酸度導致被動(dòng)滲透性差，由于C2羧酸與HDM2的His96側鏈發(fā)生了關(guān)鍵的氫鍵作用，默克公司做了羧酸的生物電子等排來(lái)改造結構。最終得到圖4中的化合物16，細胞活性進(jìn)入百納以?xún)取５腔衔?6在大鼠中的清除率高達73 mL/min/kg，生物利用度也只有2%，仍需接著(zhù)改。默克研發(fā)人員認為，高的親脂性導致了脫靶和較差的PK，他們后續采取了一種策略，專(zhuān)注于降低總體log D和提高分子的LLE。
圖5 C6位的構效關(guān)系
從圖5可以看出，嘌呤骨架中的X改為C，可以降低分子的酸性，提高PKa，此外，基于嘌呤衍生化合物的NMR-based模型，嘌呤N3和N9都位于HDM2表面的疏水區域，改成碳原子也有利于疏水結合；最終間氯吡啶環(huán)的引入得到了化合物42，與16相比，LLE由5.93提高至6.53，LogD由3.27降低至2.69. 但是化合物42的PK仍然有缺陷。
圖6 咪唑嘧啶骨架上對PK優(yōu)化
對PK繼續優(yōu)化，42的MRT在兩種種屬中都很短(在大鼠和狗中分別為0.4和1.7 h)，這表明需要優(yōu)化來(lái)實(shí)現低劑量給藥，MetID對42的研究指出親脂取代的嗎 啡啉和環(huán)己基甲基是易代謝位點(diǎn)。因而把甲基去掉，同時(shí)封閉嗎啉環(huán)上的易代謝位點(diǎn)，得到了化合物56，在犬和大鼠中的PK均比較優(yōu)秀。
圖7 大鼠、狗和恒河猴的臨床前PKs
最后，詳細的在大鼠、犬和恒河猴體內進(jìn)行了單次靜脈或口服給藥后的PK研究。化合物56在體外和體內清除存在物種差異，其中犬清除低，猴和大鼠清除中等；此外56在犬中有很好的口服生物利用度，在大鼠中具有中等的生物利用度，這可能是由于肝 臟首過(guò)效應的差異。盡管存在這些差異，但在不同物種間觀(guān)察到很強的體外/體內相關(guān)性，支持了一個(gè)可靠的人體內PK預測。根據默克的第一代HDM2抑制劑MK-8242的臨床經(jīng)驗，設定了25 μM h的人的目標暴露量（AUC）。將這些分析與預測的人藥代動(dòng)力學(xué)相結合，預測56給藥下人的劑量為75 mg QD (38 mg BID)。與MK-8242達到相同暴露水平所需的劑量相比，以及與其他第一代HDM2抑制劑療效所需的劑量相比，這一低劑量代表了顯著(zhù)的改善。化合物56也被稱(chēng)為MK-4688，目前仍在臨床前繼續進(jìn)行安全性研究。
參考文獻：
1，B. Wesley Trotter et al; Discovery of MK-4688: an Efficient Inhibitor of the HDM2?p53
Protein?Protein Interaction, doi.org/10.1021/acs.jmedchem.1c01524。
2，諾華股份有限公司；MDM2抑制劑的延長(cháng)的低劑量方案；WO2020/128892。
3，網(wǎng)站：https://clinicaltrials.gov/ct2/home。
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