在過去的十年中，靶向蛋白降解技術(shù)飛速發(fā)展，已成為一種新型的治療策略。TPD技術(shù)可以利用細胞泛素依賴的蛋白水解系統(tǒng)有效降解目標蛋白。盡管到目前為止已經(jīng)報道了多種PROTAC，但所使用的E3連接酶配體大多局限于CRBN或VHL配體。

       此外，有研究表明基于CRBN配體或VHL配體的PROTACs會產(chǎn)生耐藥性等問題，這些PROTACs由于E3連接酶的細胞類型特異性表達而顯示出局限性。為了克服這些障礙，各種E3連接酶配體的開發(fā)已成為人們關(guān)注的焦點，以改進當前的PROTAC技術(shù)。

       什么是PROTAC？

       靶向蛋白降解(Targeted Protein Degradation, TPD)是一種新興的治療策略，被認為是克服傳統(tǒng)藥物開發(fā)局限性的解決方案。

       TPD通過E3連接酶，進而誘導(dǎo)泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)選擇性地降解目標蛋白(POI)。

       PROTAC由一個與E3連接酶配體、一個靶向POI的配體和配體之間的化學(xué)連接鏈組成（圖1）。與PROTAC一起，使用蛋白質(zhì)標簽的蛋白質(zhì)降解策略已經(jīng)開發(fā)出來，如dTAG、AiD和SMASh Tag技術(shù)，他們同樣是通過誘導(dǎo)鄰近的POI泛素化降解POI。

       圖1.PROTAC作用機制

       圖片來源：Arvinas官網(wǎng)

       盡管人類細胞中有超過600種E3連接酶，但只有非常有限數(shù)量的E3連接酶被用于PROTAC技術(shù)(CRBN, VHL, IAP和MDM2)。目前為止，大多數(shù)PROTACs都局限于CRBN或VHL。

       然而，最近關(guān)于CRBN或VHL的PROTACs耐藥的研究強烈表明，要充分利用PROTAC策略，需要發(fā)現(xiàn)更多的E3連接酶配體。

       此外，考慮到許多E3連接酶已被證明在特定類型的細胞或組織中過表達。例如，大腦(FBXL16, KCTD8)、胰 腺(ASB9)、骨骼肌(KLHL40, KLHL41)、睪丸(DCAF4L1)、輸卵管(DCAF8L1)。

       開發(fā)新的E3連接酶可能為PROTACs提供更好的機會，可以開發(fā)出具有更高的選擇性和特異性的PROTAC，用于有效的疾病治療。

       已開發(fā)的E3泛素連接酶配體

       CRBN配體

       在20世紀50年代，沙利度胺(1)首先由celgene開發(fā)，作為孕婦晨吐的鎮(zhèn)靜劑。然而，在20世紀60年代初，沙利度胺因其嚴重的致畸作用被撤出市場。

       而后，沙利度胺被重新開發(fā)為一種有前途的免疫調(diào)節(jié)亞胺藥物(IMiD)，并被批準用于治療麻風結(jié)節(jié)性紅斑(ENL)和多發(fā)性骨髓瘤(圖2)。

       然而，沙利度胺的作用機制一直未被闡明，直到2010年Ito等人發(fā)現(xiàn)沙利度胺的靶蛋白是E3泛素連接酶CRL4CRBN的一個亞基。除沙利度胺外，2011年，該團隊也鑒定了泊馬度胺（2）和來那度胺（3）的靶蛋白也為CRBN。

       2018年，Crew小組報告了22種沙利度胺類似物，其中3種沙利度胺類似物(4,5,6)表現(xiàn)出更好的藥理特性和良好的CRBN結(jié)合親和力(4,5,6的Kd分別為555,549和111 nM)。他們發(fā)現(xiàn)，沙利度胺中鄰苯二酰亞胺部分的化學(xué)修飾并沒有導(dǎo)致CRBN結(jié)合親和力的顯著下降。

       C4 Therapeutics申請了CRBN配體的合成專利，他們報道了各種哌啶2,6-二酮衍生物。熒光偏振(FP)實驗表明化合物7是最 佳的CRBN配體之一。

       此外，他們發(fā)現(xiàn)進一步簡化得到的化合物8對CRBN同樣具有納摩爾的親和力。

       Hwang小組設(shè)計了1-氨基苯并三唑-戊二酰亞胺作為新的CRBN配體，并發(fā)現(xiàn)了TD-106(9)，TD-106(9)為直接CRBN配體。

       2019年，Kymera Therapeutics報告了各種CRBN配體，這些配體具有兩個環(huán)，與不同的連接劑綴合。其中效果最好是化合物10和SB572027 (11)。目前，其中一個配體SB572027(11)被百濟神州(Beigene)用于合成靶向BTK的PROTAC。

       2021年，Rankovic小組用苯基取代了沙利度胺的鄰苯二酰亞胺基團，合成了苯酰戊二酰亞胺(PG, 12)。與沙利度胺(t1/2 = 3.3 h)相比，PG (12, IC50 = 2.191μM)表現(xiàn)出更為出色的穩(wěn)定性。

       2021年，上海藥物所王明亮團隊申請了CRBN配體的合成專利，包括化合物13和14。

       2021年，諾華公司開發(fā)了基于CRBN配體15 和16的BRD9降解劑。并且，這些降解劑可以在納摩爾濃度可以有效降解BRD9 。

       圖2.CRBN配體化學(xué)結(jié)構(gòu)

       VHL配體

       VHL蛋白是Cullin 2 E3連接酶的底物受體蛋白。缺氧誘導(dǎo)因子1α (HIF-1α)是VHL的底物蛋白之一。

       2012年，Ciulli和Crews小組首次報道了一系列針對VHL的小分子抑制劑。他們合成了一個羥基脯氨酸衍生物庫，發(fā)現(xiàn)了VHL/HIF-1α相互作用的抑制劑。其中，VHL配體17對VHL具有個位數(shù)的微摩爾活性。（圖3）。

       在后續(xù)研究中，Ciulli團隊基于x射線晶體結(jié)構(gòu)，設(shè)計優(yōu)化了初始VHL配體，并于2014年報道了新的VHL配體VH03218(Kd = 185 nM)和19 (KD = 291 nM)，具有納摩爾結(jié)合親和力。

       2015年，Crews團隊提出了HaloPROTAC的概念，同時設(shè)計出了VHL配體20，以此構(gòu)建出的HaloPROTAC成功降解了目標蛋白 p38δ。

       圖3.已報道的VHL配體

       2018年，Ciulli報告了VH298 (21, KD = 52 nM)和VH101 (22, KD = 16 nM)，他們發(fā)現(xiàn)，增加VHL配體的親脂性導(dǎo)致更高的細胞通透性和更高的VHL蛋白結(jié)合親和力。

       2018年，Ciulli團隊報道了具有不同立體化學(xué)特征的氟羥脯氨酸(F-Hyp) VHL配體。他們合成了4種含有VHL配體的3-氟-4 -羥基脯氨酸的非對映異構(gòu)體，發(fā)現(xiàn)VHL可以立體選擇性地識別F-Hyp的(3R,4S)外映體(23)。

       2019年，王少萌小組在前期工作的基礎(chǔ)上，通過在VH101上引入(S)-甲基，發(fā)現(xiàn)了新的VHL配體。通過SAR研究，他們發(fā)現(xiàn)在(S)甲基上添加酰胺基團可以增加VHL配體的親和力；基于FP的結(jié)合實驗表明，VHL-e(24)與VHL具有較高的親和力(IC50 = 190 nM)。

       隨后，王少萌團隊進一步開發(fā)了弱結(jié)合VHL配體，VHL-g (25)，同樣對VHL蛋白顯示出高度的親和力。

       Wang小組進一步開發(fā)了VHL配體(26)，與 ER調(diào)節(jié)劑雷洛昔芬構(gòu)建了靶向ER的高效降解劑。

       IAP配體

       凋亡蛋白抑制劑IAPs是細胞死亡的調(diào)節(jié)因子，可控制由多種刺激引起的凋亡過程。

       2007年，Vucic小組開發(fā)了一種細胞凋亡抑制劑1和2 (c-IAP1和c-IAP2)拮抗劑(MV1, 27)，它與IAP蛋白的IAP重復(fù)(BIR)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，導(dǎo)致 c-IAP的自泛素化和降解(KD = 5.8 nM)（圖4）。

       后來，Sekine等人報道了一種不同的cIAP1配體，貝斯他丁甲酯(ME-BS, 28)。

       2012年，基因泰克公司發(fā)現(xiàn)了cIAP1/2、ML-IAP和XIAP的一種有效拮抗劑。他們通過基于晶體結(jié)構(gòu)的SAR研究開發(fā)了一種廣譜IAP抑制劑GDC-0152 (29)。

       2012年，軒尼詩研究小組發(fā)現(xiàn)了一系列基于氨基哌啶的IAP抑制劑。他們發(fā)現(xiàn)，以船型固定的雙環(huán)哌啶(30 (XIAP-BIR3的KD = 0.9 μ M)是cIAP1的有效抑制劑。

       2013年，Cosford小組報道了一種有效的IAP拮抗劑。其中，IAP拮抗劑(31)對IAP的結(jié)合親和力最好。

       2014年，百時美施貴寶報道了異二聚IAP拮抗劑（32）對IAP具有高度親和力，并具有出色的IAP抑制活性(IC50高達3.6 nM)。

       此外。輝瑞基于化合物32合成了，一種BTK PROTACBC5P (DC50 = 182 nM)。

       2017年，Naito團隊開發(fā)了IAP配體LCL-161（33）及LCL-161衍生物（35、36），并開發(fā)了基于這些IAP配體的ER SNIPER, 成功降解了ER。

       Astex制藥公司通過基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)策略，成功發(fā)現(xiàn)了一種非擬肽cIAP1和XIAP抑制劑AT-IAP(34)。

       AT-IAP(34)對XIAP和cIAP1表現(xiàn)出強烈的雙重拮抗作用(XIAP EC50 = 5.1 nM, cIAP1 EC50 = 0.32 nM)。

       2020年，葛蘭素史克報告了一種基于哌柏西利的PROTAC，該PROTAC具有IAP 親和力 (37)，可用于降解CDK4和CDK6。

       圖4. 已報道的IAP配體

       MDM2配體

       MDM2蛋白是一種E3泛素連接酶，調(diào)節(jié)p53的泛素化和降解。

       2004年，羅氏公司報告了一種強效的、高選擇性的MDM2-p53相互作用的小分子抑制劑。他們通過篩選合成化合物庫確定Nutlin3(38)對MDM2具有高度親和力（圖5）。

       值得注意的是，順式咪唑啉Nutlin-3(38)的兩個對映體對MDM2具有高度不同的結(jié)合親和力(對映體a = 13.6 μ M，對映體b = 0.09 μ M)。

       2008年，Crews小組首次報道了基于MDM2的PROTAC，通過結(jié)合Nutlin-3(38)和一個具有PEG連接物的非甾體AR配體。

       圖5.已報道的MDM2配體

       2013年，Roche根據(jù)p53-MDM2配合物的晶體結(jié)構(gòu)對nutin -3(38)化合物進行優(yōu)化，合成了一種新的MDM2抑制劑RG7112(39)，在咪唑啉環(huán)上進行二甲基取代，用叔丁基取代甲氧基(IC50 = 18 nM)。RG7112是臨床試驗中首 個口服p53-MDM2抑制劑。

       他們用吡咯烷部分取代了RG7112的咪唑啉結(jié)構(gòu)，并引入了立體化學(xué)結(jié)構(gòu)以獲得更高的親和力的MDM2抑制劑RG7388(40)，具有優(yōu)異的療效和選擇性 (IC50 = 6 nM)。

       DCAF 配體

       磺胺類衍生物因其抗菌、抗真菌、抗病毒和抗癌活性而備受關(guān)注。Nijhawan的研究報道，磺胺衍生物indisulam (41)， E7820(42)和chloroquinoxaline sulfonamide (CQS, 43)作為一種分子膠，誘導(dǎo)E3連接酶和靶蛋白之間的蛋白-蛋白相互作用（圖6）。

       2019年，Cravatt團隊使用化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方法確定了DCAF16 E3連接酶作為他這些化合物（41、42、43、44）的靶蛋白。

       基于類似的篩選策略，Cravatt小組也開發(fā)出E3連接酶DCAF11的親電配體(45)。利用發(fā)現(xiàn)的配體45，他們合成了靶向AR PROTAC，并成功降解AR。

       圖6.已報道的DCAF配體

       RNF配體

       2019年，野村研究小組使用基于ABPP的共價配體篩選方法，報告了一組E3連接酶RNF4的配體。他們發(fā)現(xiàn)優(yōu)化的共價配體CCW16(46)對RNF4具有高度親和力。

       此外，該小組還報道了Nimbolide(47)，一種具有抗癌活性的天然產(chǎn)物，被鑒定為E3連接酶RNF114的共價配體。

       在2021年，野村團隊同樣基于ABPP的方法發(fā)現(xiàn)了共價配體EN219(48)，可以靶向RNF114 (IC50 = 470 nM)（圖7）。

       圖7.已報道的RNF配體

       AhR配體

       2019年，Naito團隊開發(fā)了一種新的PROTAC，可以招募芳基烴受體(AhR) E3連接酶復(fù)合物。他們將AhR配體(β-NF, 49)與ATRA結(jié)合，形成了一個嵌合分子β-NF-ATRA。β-NF-ATRA是一種招募CRABPs的PROTAC，通過泛素-蛋白酶體途徑以AhR依賴的方式誘導(dǎo)CRABPI和CRABPII降解（圖8）。

       圖8. 已報道的AhR配體

       FEM1B配體

       CUL2 E3連接酶FEM1B最近被發(fā)現(xiàn)是細胞對還原應(yīng)激反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子。2022年，野村研究小組發(fā)現(xiàn)了一種基于氯乙酰胺的共價配體EN106(50)(圖9)，可作為一種FEM1B配體(IC50 = 2.2μM)。

       圖9.已報道的FEM1B配體

       KEAP1配體

       研究表明KEAP1與Nrf2相互作用可以調(diào)節(jié)細胞保護蛋白。因此，基于KEAP1-Nrf2的蛋白-蛋白相互作用抑制劑的發(fā)現(xiàn)在應(yīng)激相關(guān)疾病的治療中引起了人們的關(guān)注。2020年，野村研究小組使用已知的KEAP1配體 (RTA 402,甲基巴多索隆(CDO- Me, 51)作為E3泛素連接酶配體，報告了一種可逆共價結(jié)合PROTAC。（圖10）。

       圖10.已報道的KEAP1配體

       2021年，金堅團隊報道了E3連接酶KEAP152，并開發(fā)了一種招募KEAP1的PROTAC MS83。

       2022年，Lv團隊發(fā)現(xiàn)了一種天然產(chǎn)物Piperlongumine (PL, 53)，作為E3連接酶配體。他們首先用競爭性的ABPP試驗證實了PL(53)與多個E3連接酶結(jié)合。并且，他們發(fā)現(xiàn)當E3連接酶配體與靶蛋白配體偶聯(lián)后，E3連接酶的選擇性進一步提升。

       小 結(jié)

       PROTAC在過去的20年里已經(jīng)發(fā)展成為治療疾病領(lǐng)域的新策略。為了實現(xiàn)有效的TPD, E3連接酶配體和靶蛋白配體的選擇是PROTAC設(shè)計的關(guān)鍵。盡管到目前為止，已經(jīng)報道了多種E3泛素連接酶種類，但目前只有少數(shù)E3連接酶配體可用于TPD。

       在過去的幾十年里，PROTAC的大部分研究都集中在使用CRBN或VHL配體的各種藥物靶蛋白的TPD上。然而，由于CRBN或VHL的細胞類型或組織類型依賴的表達差異化，靶蛋白降解經(jīng)常受到抑制。此外，最近觀察到對CRBN或VHL的PROTACs的耐藥性。

       而尚未開發(fā)的細胞或組織類型特異性E3連接酶將是一種新型PROTAC的研究基礎(chǔ)，它可以以空間特異性的方式控制某種蛋白質(zhì)的降解。因此，新型E3連接酶配體的發(fā)現(xiàn)將是一個重要的研究目標，以擴大PROTACs的應(yīng)用前景。期待PROTAC技術(shù)的早日成熟，為患者帶來福音！

       參考文獻

       1.Discovery of E3 Ligase Ligands for T arget Protein Degradation. https://doi.org/10.3390/molecules27196515

       2.Advances in targeted degradation of endogenous proteins. Cell Mol. Life Sci. 2019, 76,2761–2777

       3.Targeted Protein Degradation Tools: Overview and Future Perspectives. Biology 2020, 9, 421

       4.Major advances in targeted protein degradation: PROTACs, LYTACs, and MADTACs. J. Biol. Chem. 2021,296, 100647.

       5.C. Molecular Glues for Targeted Protein Degradation: From Serendipity to Rational Discovery . J. Med. Chem. 2021, 64, 10606–10620.