內吞作用是細胞攝取營(yíng)養物質(zhì)、調節跨膜動(dòng)力學(xué)、突觸囊泡再循環(huán)等方面的重要過(guò)程。內吞作用也可以在正常細胞中包括IgG/ADC在內的大分子的攝取和分布中發(fā)揮重要作用。內吞作用大致分為吞噬作用（顆粒內化）和胞飲作用(可溶性分子內化，也稱(chēng)為液相內吞作用）。此外，根據內吞囊泡形成的大小，內吞作用被分為宏觀(guān)的和微觀(guān)的內吞過(guò)程。表3列出了可能導致IgG/ADC非特異性攝取的主要內吞機制的關(guān)鍵特征。

       表3 主要內吞機制的關(guān)鍵特征

       “大尺度”的內吞作用包括吞噬和大胞吞作用，它們分別涉及大顆粒和大體積粒子的內化。吞噬作用包括吸收體積較大的顆粒，從而引起細胞膜的變形(局部的肌動(dòng)蛋白的重新排列)。含有ADC或ADC聚集物的免疫復合物也有可能被這一過(guò)程吸收。

       與吞噬作用類(lèi)似，巨胞吞作用也是一個(gè)肌動(dòng)蛋白依賴(lài)的過(guò)程，它涉及在相對大量的細胞外液（而不是顆粒）區域周?chē)纬少|(zhì)膜的褶皺延伸，以介導內吞作用。微尺度內吞過(guò)程包括小于200 nm的小粒體吞噬。

       這些過(guò)程通常需要特殊的外殼蛋白，如網(wǎng)格蛋白或小泡蛋白（圖2）。配體與特定的膜受體的結合啟動(dòng)了一系列的信號事件，導致特定的適配器蛋白的募集，以實(shí)現網(wǎng)格蛋白包被的囊泡的形成。這些新形成的囊泡被動(dòng)力蛋白（GTPase酶）切斷，并被釋放用于進(jìn)一步的細胞內運輸。

       小泡蛋白介導的內吞作用涉及由膜涂層蛋白小泡蛋白形成的瓶狀結構（小泡），它也依賴(lài)于動(dòng)力蛋白來(lái)切斷囊泡。小泡蛋白介導的攝取在許多類(lèi)型的細胞中起著(zhù)主要的運輸作用，尤其在內皮細胞中占主導地位。

       圖2 宏觀(guān)尺度和微觀(guān)尺度內吞過(guò)程的關(guān)鍵結構特征示意圖

       總的來(lái)說(shuō)，上述宏觀(guān)和微觀(guān)的內吞過(guò)程可能有助于A(yíng)DC進(jìn)入正常細胞。關(guān)于A(yíng)DC對正常細胞的毒 性，非特異性?xún)韧虣C制如小泡依賴(lài)性?xún)韧獭⒕薨毯屯淌勺饔檬菨撛诘闹匾獧C制。也很明顯，內吞機制和總的內吞率在正常組織和細胞類(lèi)型中是不同的。

       許多特化的免疫細胞（包括巨噬細胞和樹(shù)突狀細胞）具有更高的內吞率。例如，Kupffer細胞（肝 臟中的常駐巨噬細胞）在包括ADC在內的免疫偶聯(lián)物的非特異性攝取和清除中發(fā)揮主要作用。由于內皮細胞位于血管和間質(zhì)腔室之間的界面，因此它們也具有較高的大分子內吞率。了解不同正常細胞/組織的內吞速率對于理解非特異性?xún)韧套饔米鳛锳DC攝取和毒 性的潛在機制的作用是有價(jià)值的。

       影響IgG/ADC非特異性?xún)韧套饔玫囊蛩兀捍蠓肿拥睦砘再|(zhì)可能會(huì )影響在正常細胞/組織中內吞。IgG/ADC表面的分子電荷是共同影響抗體組織分布和PK的眾多參數中的一個(gè)重要參數。帶正電荷的分子被吸引到哺乳動(dòng)物細胞膜以及細胞外基質(zhì)（硫酸肝素蛋白聚糖）中帶負電荷的基團上。增加了ADC局部濃度，導致正常組織/細胞中更多的非特異性?xún)韧虜z取。

       總的來(lái)說(shuō)，IgG抗體凈正電荷的增加導致組織分布的增加，血漿清除率的增加，而凈正電荷的減少則導致組織分布的減少。重要的是，至少一個(gè)或多個(gè)單位的等電點(diǎn)（pI）的變化足以產(chǎn)生組織分布和PK的可測量的變化。這些結論也可能適用于A(yíng)DC，支持了ADC電荷可能影響正常細胞的非特異性?xún)韧套饔玫募僬f(shuō)。因此，電荷修飾：通過(guò)減少正電荷或平衡整體表面電荷分布，是設計ADC時(shí)考慮的一種方法。

       但值得注意的是，與正常組織類(lèi)似，電荷修飾也可能影響腫瘤細胞療效所需的靶抗原依賴(lài)的ADC攝取。優(yōu)化ADC表面電荷，減少正常細胞攝取，同時(shí)在腫瘤細胞中保留靶介導的攝取，可以有利于改善TI。

       ADC的疏水性也可能在正常細胞對其非特異性攝取中發(fā)揮作用。許多用于A(yíng)DC的藥物連接子組合都是疏水的；使抗體具有顯著(zhù)的疏水性，特別是對于高DAR的ADC。高DAR的疏水性增加可促進(jìn)ADC的聚集并加速非特異性清除。與肝細胞類(lèi)似，具有高DAR的ADC可能被其他具有高非特異性?xún)韧棠芰Φ恼＜毎杆偾宄瑥亩鴮е旅摪卸?性。

       非特異性?xún)韧套饔茫ㄌ貏e是巨胞吞作用）被認為是正常角膜上皮細胞和巨核細胞攝取ADC的途徑，分別導致眼部毒 性和血小板減少。同樣，大胞飲作用介導的內化可以降低ADC（AGS-16C3F）對巨核細胞的毒 性（血小板減少癥）。

       3受體介導的攝取機制

       ADC的靶點(diǎn)依賴(lài)性攝取和毒 性也可以由不同的受體介導，這些受體識別ADC中IgG部分的Fc（片段結晶）區域（圖3）。IgG恒定結構域在結構上高度保守，允許通過(guò)Fc受體與免疫系統的其他組分相互作用，從而啟動(dòng)效應免疫功能。雖然Fc介導的效應功能通常不需要實(shí)現ADC的療效，但Fc受體與ADC抗體（IgG）成分的識別和結合可以介導正常細胞的非靶點(diǎn)內化。

       圖3 ADC IgG部分結構示意圖

       Fcγ受體（FcγRs）：FcγRs通過(guò)抗體介導的效應功能（如抗體依賴(lài)性細胞毒 性（ADCC）、補體依賴(lài)性細胞毒 性（CDC）、吞噬細胞因子（IFN-γ和TNF-α）和其他IgG免疫復合物和釋放細胞因子），在連接細胞和體液免疫反應中發(fā)揮著(zhù)關(guān)鍵作用。這些效應功能在調節幾種治療性IgG抗體的療效中發(fā)揮著(zhù)重要作用。FcγR介導的效應功能對靶相關(guān)療效至關(guān)重要，但可能有助于正常細胞中脫靶的攝取和毒 性。

       因此，了解FcγR生物學(xué)、正常細胞/組織中的表達方式以及有助于FcγR結合的ADC的理化因子，對于理解潛在脫靶毒 性機制具有重要意義。根據受體交聯(lián)后啟動(dòng)的信號通路類(lèi)型，FcγRs主要分為激活型（FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc、FcγRIIIa和FcγIIIb）和抑制型（FcγRIIb1/b2）受體。

       激活型FcγRs與免疫受體酪氨酸激活基序（ITAM）的相互作用正向調節效應功能，而抑制型受體與免疫受體酪氨酸基抑制基序（ITIM）的相互作用，負調控IgG介導的效應功能，包括內吞/吞噬作用。除了免疫細胞，不同FcγRs的表達顯示在多個(gè)其他正常細胞類(lèi)型包括表皮角質(zhì)形成細胞，感覺(jué)神經(jīng)元、系膜細胞、破骨細胞、內皮細胞、成纖維細胞、唾液腺上皮細胞、各種細胞類(lèi)型在腎 臟和眼睛，巨核細胞、血小板，以及分化骨髓來(lái)源的未成熟細胞，包括造血干細胞/祖細胞。

       FcγR介導的IgG/ADC內化：FcγRs不僅是介導IgG抗體效應功能的重要分子，而且是最 具特征的內吞細胞表面受體之一，在體循環(huán)中內化/清除IgG調理抗原中發(fā)揮作用。FcγRs與Fc區域的結合誘導了細胞上IgGs的聚集/交聯(lián)，并啟動(dòng)下游信號事件，導致PI3K、p70S6K和Akt等激酶的磷酸化和激活。這些直接參與了肌動(dòng)蛋白細胞骨架的重組和假足和吞噬體形成的膜重塑。類(lèi)似的機制也可能適用于FcγR介導的ADC內化，有助于正常細胞的非靶點(diǎn)依賴(lài)性毒 性。

       正常細胞中ADC毒 性與FcγRs介導的ADC攝取相關(guān)。盡管FcγRs在正常健康細胞/組織中的表達模式與幾種報道的ADC靶無(wú)關(guān)毒 性相對應，FcγRs在介導ADC脫靶毒 性中的作用主要被認為是血液毒 性（血細胞毒 性）的潛在機制。血液毒 性是含有奧司汀（MAME，MMAF）、鈣霉素和類(lèi)玉米霉素（DM-1）的ADC最常見(jiàn)的脫靶毒 性。在臨床研究中，T-DM1誘導的血小板減少癥為一種DLT。

       新生兒Fc受體（FcRn）：FcRn是MHCI類(lèi)糖蛋白的成員，專(zhuān)門(mén)綁定到Fc域和發(fā)揮關(guān)鍵作用，其特點(diǎn)是半衰期（~21天）較長(cháng)。與其他Fc受體不同，FcRn依賴(lài)pH的方式與配體相互作用，在微酸性pH（~6.5）下具有高親和力結合。這種pH依賴(lài)性被認為是FcRn延長(cháng)IgG/ADC半衰期機制的關(guān)鍵。FcRn廣泛表達于許多正常的成人組織/細胞類(lèi)型中（表4）。

       特別是血管內皮細胞和髓系來(lái)源的造血細胞（抗原提呈遞細胞）在FcRn介導的免疫反應中發(fā)揮主導作用，由此也影響IgG/ADC的分解代謝和PK。在極化的上皮細胞（如腸上皮細胞、腎近端腎小管上皮細胞）中表達的FcRn也有助于IgG或免疫復合物的雙向胞吞作用。

       FcRn的表達模式在不同物種中可能不同，導致人類(lèi)和其他臨床前物種之間的IgG結合親和力存在差異。雖然人類(lèi)FcRn只與人類(lèi)IgG結合，但小鼠FcRn高度混雜，并與來(lái)自多個(gè)物種（包括人類(lèi)）的IgG結合，具有比小鼠IgG更高的親和力（~10倍）。人IgG與食蟹猴FcRn的結合親和力也比與人FcRn的值高2倍。

       表4 FcRn在不同正常細胞/組織中的表達

       FcRn結合及其在A(yíng)DC毒 性中的潛在作用：ADC主要通過(guò)非特異性流體相內吞作用，在酸性早期核內體結合FcRn，然后，在中性pH細胞外空間或體循環(huán)，FcRn-ADC復合物分為循環(huán)核內體轉移遠離溶酶體降解和回收回細胞表面釋放ADC。在每個(gè)內吞作用周期中，只有未與FcRn結合的ADC被轉運到溶酶體中進(jìn)行分解代謝和釋放有效載荷（圖4）。

       從安全性的角度來(lái)看，FcRn結合對于減少正常細胞中ADC的積累和分解代謝以釋放細胞毒 性有效載荷也很重要。因此，在FcRn顯著(zhù)表達的正常細胞中，對FcRn結合的修飾可能是克服不良毒 性/不良事件的有用方法。

       圖4 FcRn在A(yíng)DC循環(huán)中的作用

       C型凝集素受體（CLRs）：CLR是一個(gè)龐大、高度保守且特征良好的內吞受體家族。I型CLR是鈣依賴(lài)的，有多個(gè)（6到8）碳水化合物識別域（CRDs），也包含富含半胱氨酸和纖維連接蛋白結構域。其成員包括巨噬細胞甘露糖受體（MR、MRC1、CD206）、Endo180（CD280、MRC2、uPAR相關(guān)蛋白、uPARAP）、DEC-205、PLA2R和DCL-1。II型CLRs包含一個(gè)CRD，可以鈣依賴(lài)Dectin 2、Mincle、CLECSF8、DCIR、DCAR、BDCA-2、DC-SIGN、MGL，鈣不依賴(lài)Dectin 1、CLEC5A、DNGR-1（CLEC9A）。

       CLR既可以是膜結合的（主要），也可以是可溶性/分泌的，主要存在于髓系細胞上。越來(lái)越多的證據也表明，CLR在多種正常上皮細胞和內皮細胞中具有功能性表達，包括真皮微血管內皮細胞（DMECs）、肝竇內皮細胞（LSECs）、血管周?chē)∧z質(zhì)細胞、腎小球系膜細胞和角膜上皮細胞。

       值得注意的是，盡管CLR在各種正常組織中表達，但某些病理生理事件，如炎癥和感染（真菌、微生物）已被證明可以顯著(zhù)調節這些受體的表達。CLR在一些正常組織中重要的內吞功能和結構性表達，包括常見(jiàn)的ADC靶器官（肝 臟、皮膚和角膜），表明這些受體可能在這些組織中介導非靶向的ADC內化和毒 性中發(fā)揮作用。

       ADC毒 性與CLRs結合相關(guān)。盡管沒(méi)有明確的證據證明CLR在A(yíng)DC的脫靶毒 性中起直接作用，但甘露糖受體（MR）介導的攝取認為是ADC肝毒 性的潛在機制。LSECs是一種高度特化的內皮細胞。與其他肝細胞相比，LSECs中的溶酶體酶活性水平顯著(zhù)升高，也可能進(jìn)一步導致其內吞配體（包括ADC）的高度降解，并將降解的物質(zhì)/細胞毒 性有效載荷釋放到周?chē)那皇摇?/p>

       LSECs依賴(lài)于MR介導的對溶酶體酶（糖蛋白）的攝取來(lái)維持其高降解能力。在早期核內體中釋放配體后，MR-配體復合物的快速內化和MRs的快速循環(huán)回到細胞表面可能進(jìn)一步有助于MR表達細胞的高連續內吞能力。MR介導的攝取也是清除LSECs中內源性和治療性糖蛋白和免疫球蛋白的重要機制。

       此外，由于存在被微管（肌動(dòng)蛋白）絲包圍的大孔（~50-150nm），沒(méi)有膈膜和基底膜，LSECs是體內通透性最 好的內皮細胞類(lèi)型。因此，大分子（包括ADC）通過(guò)膜孔進(jìn)入LSECs的清除劑受體擴散也可能導致肝毒 性。

       值得注意的是，Kupffer細胞也表達MR，并在A(yíng)DC的非特異性攝取和加工中發(fā)揮重要作用。因此，不能排除MR介導的Kupffer細胞中ADC的攝取和細胞毒 性有效載荷釋放到周?chē)毎校瑥亩鴮е赂味?性。

       總結

       ADC毒 性主要為骨髓/血液學(xué)、肝 臟、眼睛、周?chē)窠?jīng)、腎 臟和漿膜積液（血管滲漏綜合征）。受體依賴(lài)和不依賴(lài)的機制可能有助于了解ADC脫靶毒 性。這些機制可能因不同的細胞/組織類(lèi)型而不同，這取決于關(guān)鍵候選受體的表達和功能。常見(jiàn)的DLT包括血小板減少癥（FcγRIIa介導或大胞吞介導）、眼毒 性（大胞吞介導）、中性粒細胞減少（細胞外蛋白酶介導）、肝損傷（甘露糖受體介導）和周?chē)窠?jīng)病變（循環(huán)）與ADC/有效載荷攝取的潛在機制有關(guān)。

       總而言之，選擇性地用ADC靶向表達的腫瘤細胞比最初預期的要復雜得多。簡(jiǎn)單地選擇在正常組織中很少/不表達、腫瘤中高表達的抗體靶點(diǎn)，不足以在體內將ADC有效載荷傳遞給腫瘤細胞，同時(shí)最大限度地減少對正常細胞的毒 性。非特異性ADC進(jìn)入正常細胞的途徑，可能因細胞類(lèi)型而異，且取決于A(yíng)DC本身特征。迄今為止，并不是所有影響非特異性ADC吸收的參數都得到了確定，我們了解的越多，復雜性似乎就會(huì )繼續擴大。

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