歷時(shí)三年甚囂塵上的“亞硝胺事件”如今有了新的進(jìn)展。

       FDA從最初的單純亞硝胺雜質(zhì)的檢測，到開(kāi)始關(guān)注攜帶亞硝胺結構的目標產(chǎn)品雜質(zhì)。

       例如治療帕金森病的藥物雷沙吉蘭（Rasagiline，商業(yè)名稱(chēng)：Azilect?）中發(fā)現的亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)，N-亞硝基雷沙吉蘭；以及在治療動(dòng)脈硬化、自發(fā)的和腦炎性的帕金森病的藥物奧芬那君（Orphenadrine）中發(fā)現的N-亞硝基奧芬那君（叔胺也能引發(fā)亞硝胺形成的完 美案例, 圖1）。

       后者引發(fā)了Sandoz 今年5月份的13個(gè)批次的藥品召回。相對于NDMA和NDEA這樣的單純亞硝胺雜質(zhì)，這些產(chǎn)品相關(guān)的亞硝胺雜質(zhì)的上限值非常低。

       圖1. 雷沙吉蘭和奧芬那君以及它們的N-亞硝基雜質(zhì)

       EMA近日發(fā)布了針對特定藥品的亞硝酸雜質(zhì)限制指南，其中囊括了許多易感藥物。該指南對這些易感藥物的亞硝胺雜質(zhì)上限提出了建議。

       指南規定，如果某種藥物已形成亞硝胺類(lèi)雜質(zhì)，但具體限值沒(méi)有在此份指南中限定的話(huà)，將統一采取18 ng/天的ADI (Acceptable Daily Intake, 每日允許攝入量) 標準。

       FDA目前使用的標準相對寬松，為26.5 ng/天，但ANVISA (巴西國家衛生監督局), Health Canada (加拿大衛生部)， TGA (澳大利亞藥品管理局) 等監管機構都遵循EMA的18 ng/天的限值標準。

       1

       亞硝胺的遺傳毒 性和致癌性

       亞硝胺類(lèi)化合物屬于“關(guān)注類(lèi)”高誘變致癌物，該類(lèi)物質(zhì)已被世衛組織國際癌癥研究機構IARC歸入可能是人類(lèi)致癌物類(lèi)別。

       大多數亞硝胺被認為具有誘變性和致癌性，至少在動(dòng)物中是這樣，并且最強和最弱的亞硝胺之間的效力差異很大。IARC （國際癌癥研究機構）已將具有可用動(dòng)物數據的那些分類(lèi)為 2A 或 2B 類(lèi)。目前，尚缺乏足夠的物質(zhì)特異性人體數據，但只有一些與煙草相關(guān)的亞硝胺被歸類(lèi)為 1 類(lèi)（例如 NNN、NNK）。那些來(lái)自動(dòng)物數據的亞硝胺因人體數據不足被歸類(lèi)為第 3 類(lèi)。

       亞硝胺致突變性和致癌性的原理也被認為與人類(lèi)相關(guān)。在致突變和致癌性方面最受關(guān)注的是一些可能在食品中形成的揮發(fā)性亞硝胺，例如：二甲胺亞硝胺 NDMA、二乙胺 亞硝胺 NDEA、N-亞硝基吡咯烷、N-亞硝基哌啶等。

       如同亞硝酸鹽一樣，亞硝胺本身并不直接導致誘變性和致癌性。

       如圖2所示，攝入體內的亞硝胺類(lèi)物質(zhì)1，在細胞色素P450（cytochrome P450）的作用下被氧化為α-羥基亞硝胺2 。后者通常不穩定，消除一個(gè)醛分子并轉化為1-羥基-2-烷基二亞胺3。化合物3經(jīng)過(guò)脫水產(chǎn)生烷基疊氮鹽（diazonium）4，這個(gè)不穩定的疊氮鹽在釋放一分子氮氣后轉化為高活性的碳正離子5。

       在這個(gè)過(guò)程種形成的碳正離子，可以說(shuō)是亞硝胺化合物遺傳毒 性和致癌性的直接兇手，而亞硝胺（或者后退一步，亞硝酸鹽），可被視為元兇。由于高度的親電性（NDMA形成的碳正離子為甲基正離子，具有比其它烷基正離子更高的活性），碳正離子5 作為一個(gè)高效的烷基化試劑進(jìn)攻蛋白質(zhì)和DNA上的眾多親核基團，產(chǎn)生烷基化的結果，從而產(chǎn)生潛在致癌致突變型。

       圖2. 亞硝胺生物體內轉化為碳正離子，以及碳正離子修飾DNA的生化過(guò)程

       目前，FDA已經(jīng)認定了六種可能存在與藥品中的單純亞硝胺物質(zhì)，并規定了它們的ADI (每日允許攝入量)，如表1所示。

       表1. FDA認定的6種可能存在于藥品中的單純亞硝胺雜質(zhì)

       2

       亞硝胺的可能來(lái)源

       1藥物以外領(lǐng)域

       環(huán)境

       亞硝胺可以在環(huán)境中產(chǎn)生。它們在空氣中主要通過(guò)燃燒過(guò)程形成，而在水中則通過(guò)微量的生物過(guò)程形成。

       食物

       在食品中，亞硝胺的形成主要是通過(guò)肉、魚(yú)和其他產(chǎn)品中的亞硝酸鹽和亞硝胺在較高溫度下發(fā)生反應而形成的。上世紀七十年代至九十年代，這種形成和發(fā)生引起了人們的極大關(guān)注，并已采取措施減少食品生產(chǎn)中硝酸鹽和亞硝酸鹽的使用，以期最大限度地減少亞硝胺類(lèi)物質(zhì)的產(chǎn)生。

       歐洲食品安全局 (EFSA) 對此進(jìn)行了審查，該機構參考了各種調查，得出的結論是，加工肉類(lèi)所產(chǎn)生的揮發(fā)性亞硝胺物質(zhì) (如NDMA 二甲基亞硝胺，以及 NDEA 二乙基亞硝胺)，其每日最高攝入量為0.2 ng/公斤/天（嬰兒） 至3.5 ng/公斤/天（幼兒）。

       飲用水

       在德國，飲用水中 NDMA 的控制限值為 10 ng/l。加利福尼亞州的公共衛生目標是飲用水中亞硝胺的濃度上限為 3 ng/l。

       技術(shù)加工產(chǎn)品（例如農藥、橡膠、啤酒、化妝品）

       農藥、橡膠、啤酒、化妝品這些加工產(chǎn)品可能存有亞硝胺。用彈性體制成的玩具中的亞硝胺≤10 μg/kg，亞硝酸鹽≤100 μg/kg。在化妝品中，亞硝胺的含量不應超過(guò) 50 μg/kg。

       獸藥產(chǎn)品 (VMP)

       獸藥產(chǎn)品中 DNA 反應性（誘變）雜質(zhì)是指具有極高致癌效力的誘變劑（不僅包括亞硝胺，還包括其它誘變劑的“關(guān)注類(lèi)群Cohort of Concern, CoC“）。諸如類(lèi)黃曲霉毒素和烷基-偶氮基結構。即使低于 TTC（Threshold of Toxicological Concern, 毒理學(xué)關(guān)注閾值） 的攝入量，在理論上存在顯著(zhù)的致癌風(fēng)險。應根據其具體情況確定其可接受攝入量。原則上，這些具有極高的致癌效力物質(zhì)不應作為 API 或 VMP 的雜質(zhì)出現。

       2藥物中亞硝胺雜質(zhì)的產(chǎn)生

       2018年7月，在某批次的Sartan類(lèi)藥物中檢測除了超出ICH M7(R1) AI (Acceptable Intake) 規定限值的NDMA, NDEA, DIPNA 和NMBA亞硝胺雜質(zhì)。同年9月，所有歐盟授權的血管緊張素II受體拮抗劑/阻滯劑，都要求對其生產(chǎn)工藝以及產(chǎn)生亞硝胺雜質(zhì)的風(fēng)險做出徹底評估。這些藥物的共同特點(diǎn)在于，它們都含有四唑結構單元，涉及坎地沙坦、厄貝沙坦、氯沙坦、奧美沙坦和纈沙坦等一系列沙坦類(lèi)藥物（圖3）。這些藥物API合成過(guò)程中的四唑環(huán)生成反應，都可能引發(fā)亞硝胺雜質(zhì)的產(chǎn)生。

       圖3. 四唑及沙坦類(lèi)藥物化學(xué)結構

       此后，一家吡格列酮（Pio g litazone）的制造商通知歐盟當局和歐洲藥品質(zhì)量局，報告了在它們的藥物中發(fā)現了NDMA雜質(zhì)的情況。盡管其含量低于ICH M7(R1)規定的臨時(shí)限值，但亞硝胺在非沙坦類(lèi)藥物中的出現引發(fā)了關(guān)注。

       2019年7月，歐洲藥品質(zhì)量局通報了另一家制造商生產(chǎn)的纈沙坦中發(fā)現NMPA（N-亞硝基-N-甲基苯胺）的情況。2019年9月，一個(gè)批次的雷尼替丁的原料藥和成品藥中均檢測出了NDMA （圖4）。

       圖4. 吡格列酮與雷尼替丁化學(xué)結構

       從2019年5月開(kāi)始，歐洲范圍內的”Lessons Learnt Excercise”活動(dòng)廣泛開(kāi)展，以期從沙坦以及其它藥物中產(chǎn)生亞硝胺雜質(zhì)的案例中汲取教訓，并于2020年6月24日發(fā)布了最終報告。

       3

       藥物中亞硝胺的來(lái)源

       1水

       如果合成原料中便含有亞硝胺雜質(zhì)，它可能被攜帶到最終的成品。同樣，如果原料中還有亞硝酸鹽，它可以與試劑，原料，中間品，產(chǎn)物，溶劑中廣泛存在的氨基發(fā)生反應，產(chǎn)生亞硝胺。水處理的過(guò)程中可能產(chǎn)生二甲基亞硝胺（NDMA）。

       例如自來(lái)水通過(guò)氯胺化或者氯化的消毒的過(guò)程可以生成NDMA (氯胺與二甲胺之間的反應產(chǎn)生NDMA)。在陰離子交換處理水的過(guò)程中，NDMA也有可能生成。自來(lái)水中的微量亞硝胺通常經(jīng)過(guò)紫外線(xiàn)輻射的方法被去除。

       世衛組織目前規定的飲用水中NDMA的限值為0.1 微克/升 （0.1 ppb）。盡管NDMA在水中有很高的溶解度（290 g/L），但考慮到水中極低的NDMA濃度，水成為藥物亞硝胺雜質(zhì)形成主因的可能性很低。

       雖然水本身攜帶亞硝胺的可能性不大，但經(jīng)消毒處理過(guò)的水，卻有可能與藥物反應產(chǎn)生亞硝胺，這一點(diǎn)在兩份研究中被證實(shí)。第一項研究使用了氯胺化的水處理了20種藥物, 第二項研究使用的是臭氧消毒的水處理雷尼替丁。NDMA在這兩項研究中均被發(fā)現。

       2溶劑、試劑、催化劑

       亞硝酸鹽也是產(chǎn)生亞硝胺的罪魁禍首之一。亞硝酸鹽常用于有機合成，比如****的淬滅劑，這也是沙坦類(lèi)藥物產(chǎn)生亞硝胺的主因。

       常用的有機溶劑，比如二甲基甲酰胺（DMF），N-甲基吡咯烷酮 (NMP)和三乙胺 (TEA)，都可能含有不同種類(lèi)的胺類(lèi)雜質(zhì)，比如二甲胺 (來(lái)自于DMF)，4-甲氨基丁酸（來(lái)自于NMP）和二乙胺(來(lái)自于TEA)。這些仲胺雜質(zhì)有可能與亞硝酸鹽反應，生成亞硝胺。

       相轉移催化劑三乙胺鹽酸鹽（TEA.HCl）和四丁基溴化銨（TBAB）可作為前體形成NDEA（二乙基亞硝胺）和DNBA (二丁基亞硝胺)。

       3原料藥生產(chǎn)工藝導致的

       在沙坦類(lèi)藥物的合成中，四唑的環(huán)化是由有機腈與****的環(huán)加成反應在高沸點(diǎn)溶劑（如二甲基甲酰胺或者N-甲基吡咯烷酮）中實(shí)現的，反應結束后，過(guò)量的****用亞硝酸鈉淬滅。然而在這個(gè)過(guò)程中使用的二甲基甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮中分別含有二甲胺和4-甲氨基丁酸雜質(zhì)（這些雜質(zhì)即可能是這些溶劑的合成原料，也可能是溶劑分子降解的產(chǎn)物）。這些仲胺在****的淬滅反應中與淬滅劑亞硝酸鈉作用，產(chǎn)生了相應的亞硝胺NDMA (二甲基亞硝胺) 和NMBA (N-亞硝基-N-甲基-4-氨基丁酸)。

       這個(gè)過(guò)程是沙坦類(lèi)藥物產(chǎn)生亞硝胺雜質(zhì)的根本原因（圖5）。尤其是考慮到****淬滅是整個(gè)沙坦合成工藝的最后一步，產(chǎn)生的亞硝胺雜質(zhì)污染最終產(chǎn)品的可能性大大增加。

       吡格列酮案例中二甲基亞硝胺（NDMA）形成的機理類(lèi)似于沙坦，不同的是， 亞硝酸鈉與而二甲基甲酰胺并不出現在同一步反應中，而是上一步的亞硝酸鈉被部分攜帶到二甲基甲酰胺的步驟，從而形成了亞硝胺雜質(zhì)。

       圖5. 四唑環(huán)化，****淬滅，以及DMF/NMP介導的亞硝胺形成反應。

       1977年，德國德國聯(lián)邦衛生局緊急召回了氨基比林（aminophenazone）, 原因是在此藥物中發(fā)現了340ppb的二甲基亞硝胺。調查給出了此雜質(zhì)產(chǎn)生的原因是：氨基比林中的二甲氨基水解釋放二甲胺，與藥物中的痕量亞硝酸鹽雜質(zhì)反應，形成二甲基亞硝胺雜質(zhì)（圖6）。這是一個(gè)由于藥物自身降解導致亞硝胺形成的案例，也為人們提出了這樣的警示：藥品產(chǎn)物中，不僅要檢查亞硝胺雜質(zhì)，也要建立亞硝酸鹽的質(zhì)量標準。

       圖6. 氨基比林降解導致二甲基亞硝胺形成的機理

       圖7. 發(fā)現亞硝胺雜質(zhì)的藥物

       圖7總結了文獻報道過(guò)的檢測出二甲基亞硝胺的藥物結構。可以發(fā)現它們都含有二甲氨基的化學(xué)結構。

       4制劑過(guò)程中形成的

       很多賦形劑中含有ppm含量硝酸鹽或者亞硝酸鹽，比如羥基乙酸淀粉鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、預糊化淀粉、聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮 (cPVP) 和乳糖。2019年9月，一份新的二甲基亞硝胺和二乙基亞硝胺產(chǎn)生機理報告被遞交到了監管部門(mén)。該報告提出，NDMA/NDEA 似乎是在蓋箔印刷過(guò)程中形成的，N-亞硝胺的形成是由蓋箔中的硝化纖維素與含胺印刷油墨 [二甲胺 (DMA) 和二乙胺 (DEA)] 反應引起的，并通過(guò)汽化和冷凝熱封起泡過(guò)程轉移到在成品上。由于增塑硝化纖維碎片的爆燃溫度，在熱誘導分解時(shí)會(huì )產(chǎn)生不同的氮氧化物。從硝酸纖維素中釋放出氮氧化物以及隨后在印刷藥物油墨中對胺進(jìn)行亞硝化被認為是合理的。

       4

       總結

       在沙坦類(lèi)藥物召回的事件后，亞硝胺雜質(zhì)已經(jīng)成為了FDA, EMA 等藥監機構的心頭大患，各制藥企業(yè)也對其制藥工藝進(jìn)行徹查，以杜絕亞硝胺雜質(zhì)產(chǎn)生并且污染藥品的隱患。

       從目前的根源檢查來(lái)看，包括亞硝酸鹽在內的亞硝酸化物質(zhì)，在生產(chǎn)過(guò)程中與仲胺，叔胺，甚至季胺鹽的接觸，是產(chǎn)生亞硝胺的最大根源。除此之外，沙坦事件的一大警示在于，常見(jiàn)有機溶劑，例如二甲基甲酰胺，N-甲基吡咯烷酮，三乙胺等，也被視為可與亞硝酸化試劑反應而產(chǎn)生亞硝胺的前體。制造商需要對原料藥和成品藥的生產(chǎn)工藝進(jìn)行徹底專(zhuān)業(yè)的風(fēng)險分析，以評估其產(chǎn)生亞硝胺雜質(zhì)的可能性。這個(gè)過(guò)程不僅要包含生產(chǎn)工藝本身，也要擴展到所使用的原料，試劑，溶劑和包裝材料。對于有可能形成亞硝胺的工藝，需要進(jìn)行調整以規避亞硝胺的產(chǎn)生。當然，這一切都是要建立在一套有效的分析手段之上。