5月31日，CDE 連發(fā)4條技術指導原則，分別為《體內基因治療產品藥學研究與評價技術指導原則（試行）》的通告（2022年第31號）、免疫細胞治療產品藥學研究與評價技術指導原則（試行）》的通告（2022年第30號）、《體外基因修飾系統藥學研究與評價技術指導原則（試行）》的通告（2022年第29號）、《局部給藥局部起效藥物臨床試驗技術指導原則》的通告（2022年第32號）。

       具體內容如下：

       《體外基因修飾系統藥學研究與評價技術指導原則（試行）》

       一、前 言

       近年來，細胞治療和基因編輯等技術手段蓬勃發(fā)展，相關臨床醫(yī)療探索不斷深入，為嚴重和難治性疾病提供了新的治療理念和方法。日益增加的臨床需求促進了基因操作新技術的應用和更新。

       在人體外，采用基因工程技術構建的修飾系統,可有效地將遺傳物質等轉入特定目的細胞，用于修飾目的細胞的遺傳物質、改變基因表達方式或調節(jié)細胞生物特性等。目前， 慢病毒載體、γ-逆轉錄病毒載體等常見用于將嵌合抗原受體（Chimeric Antigen Receptor, CAR）基因導入 T 細胞，以實現 CAR-T 細胞對腫瘤的靶向殺傷；游離型載體（Episomal Vector）、仙臺病毒載體等可用于將轉錄因子導入細胞，通過重編程獲得誘導多能干細胞，為其衍生細胞產品的生產提供起始原材料。將來，預計會有更多樣的載體設計適用于不同類型的產品。

       基因修飾系統種類多樣，載體設計、制備過程以及質量控制等方面的差異直接影響到最終產品的安全性和有效性， 且其來源可能不同，質量管理體系存在差異。為保證基因修飾系統質量符合臨床應用的要求，需對其進行充分的質量研究。因此，有必要細化不同類型基因修飾系統藥學研究的技術要求。

       本指導原則基于當前的科學認知，針對體外用基因修飾系統提出申報上市階段的建議性技術要求，旨在為研發(fā)單位 提供指導意見，同時，也作為監(jiān)管機構評價的重要參考。本 指導原則不具有強制性，若有可替代或適用的其他研究方法， 或本指導原則中有不適用的內容，申請人/持有人可提供相 應說明及相關替代研究的支持理由和依據。隨著技術的發(fā)展、認知的深入和經驗的積累，針對本指導原則內容后續(xù)將逐步 修訂和完善。

       二、適用范圍

       本指導原則中，基因修飾系統指在人體外，將外源基因等導入細胞，通過添加、替代、補償、阻斷、修正特定基因從而為獲得細胞治療產品或細胞治療產品生產用種子細胞而使用的修飾系統?？赡艿淖饔脵C制包括細胞內表達功能性目的基因，或采用基因敲除、修復、插入等核苷酸編輯方式改變特定的基因序列等。

       目前，基因修飾系統包括慢病毒、γ-逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、仙臺病毒等病毒載體，以及 DNA、RNA、蛋白質和蛋白質-RNA 復合物等非病毒基因修飾系統。本指導原則對病毒載體類和非病毒載體類兩類基因修飾系統進行論述。隨著本領域技術的不斷更迭，新的基因修飾系統也可能應用，如適用，其藥學研究也可參考本指導原則。

       三、一般原則

       基因修飾系統的設計合理性、工藝穩(wěn)定性、質量可控性可直接影響細胞終產品的安全性和有效性，是藥學研究的重點。需要開展的藥學研究，可能包括上游設計、制備工藝、質量研究與控制、穩(wěn)定性研究等多個方面?；蛐揎椣到y的制備全過程原則上應符合藥品生產質量管理規(guī)范（GMP） 的要求，具體的要求根據其使用情形的不同可具體問題具體分析。

       基因修飾系統的質量風險雖與體內基因治療產品有相似之處，但又有別于體內基因治療產品。體外基因修飾后的細胞還可能經過體外培養(yǎng)、換液清洗步驟，在應用于人體之前還要經過細胞終產品放行檢測。因此，基因修飾系統相較于體內基因治療產品，其修飾特性可能在回輸前得到控制， 一些相關的雜質殘留可以經過質量控制后進行放行，需要結合其特點開展體外基因修飾系統的設計和質量研究與控制。

       （一）不同研發(fā)階段的一般要求

       同其他藥物的研發(fā)一樣，基因修飾系統的藥學研究也具有階段性、漸進性等特征，隨細胞終產品非臨床和不同臨床試驗階段研究的推進而變化。研發(fā)者應提前制定研究計劃和策略，鼓勵按照“質量源于設計”的理念進行相關研究，隨著研發(fā)深入，逐步優(yōu)化制備工藝，加強質量控制。

       臨床試驗申報階段，需識別和控制基因修飾系統的相關風險，明確其分子設計，完成生產用種子（如適用）的建庫和檢定，初步評估選用生產用原材料的合理性和安全性，通過工藝研究建立相對穩(wěn)定的制備工藝，開展相應的質量研究， 建立適當的質量標準，以確?；蛐揎椣到y及其所修飾細胞 臨床應用的安全性。

       基因修飾系統應用于申報上市階段的細胞產品時，隨著對工藝和質量屬性認識的加深，工藝不斷優(yōu)化，經過充分的工藝開發(fā)及驗證研究確定基因修飾系統的商業(yè)化工藝。

       如果在臨床試驗期間，基因修飾系統的工藝發(fā)生變更， 需完成基因修飾系統和相應細胞產品的可比性研究；建議在確證性臨床試驗前，完成重大變更，并確定工藝?；诔浞稚钊氲馁|量研究和多批次數據積累，制定合理的質量控制策略，明確關鍵質量屬性（Critical Quality Atribute，CQA）， 確定適宜的分析方法，進行全面的方法學驗證；同時，應關注修飾系統相關或工藝相關的雜質研究，并制定相應的風險控制策略。規(guī)范開展并完成穩(wěn)定性研究和包材相容性研究， 制定合理的貯存條件和時間。

       （二）不同來源基因修飾系統的一般要求

       基因修飾系統可能存在自行生產、委托生產、購買等多種來源，不同來源基因修飾系統遵循相同的技術要求和質量控制原則，藥學研究均可參考本指導原則開展。

       細胞終產品的上市許可持有人應對基因修飾系統的質量負主體責任，通過加強內部質量控制或對基因修飾系統生產方的審核、制定質量協議等控制相應的質量風險。如果基因修飾系統發(fā)生變更，應及時評估風險，開展相應的藥學可比性研究，在某些情況下可能還需要非臨床或/和臨床橋接研究。

       四、風險評估與控制

       （一）整體風險識別與控制策略

       基因修飾系統涉及的風險主要包括病毒載體回復突變、載體在基因組中整合致癌或致病、脫靶風險、外源因子污染、雜質殘留等。

       藥學研究可從修飾系統的設計、制備工藝和質量控制等多個方面開展風險因素的分析，識別、確定與產品質量和安全性相關的風險因素,確定研發(fā)期間所需進行風險評估的數據范圍和重點，并制定風險防控和處理措施。同時，需結合細胞類型、劑量、給藥途徑、使用人群、作用機制、體內分布、體內作用時間等方面綜合考慮風險。

       基因修飾系統設計方面，典型風險因素可能包括：風險元件的使用，同源序列可能導致的序列重組，病毒載體經相應野生型或輔助病毒互補后產生回復突變,載體在細胞中潛伏/再激活和/或動員，載體在細胞染色體整合程度和整合位點的偏好性等。制備工藝方面，相關風險因素可能包括：高風險原材料的使用，制備過程中外源因子的污染，中間產物的貯存和質量控制，有害雜質的引入與生成，以及修飾系統的基因序列穩(wěn)定性等。質量控制方面，相關風險因素可能包括：檢測方法的適用性、標準限度的合理性等。

       近年來，基于酶的基因編輯系統逐漸應用于細胞治療產品的基因修飾，常見的系統包括轉錄激活子樣效應因子核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）、規(guī)律性重復短回文序列簇-相關蛋白（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR associated protein，Cas）等。該類系統的臨床使用風險主要包括基因

       工具酶的自身**、免疫原性、基因編輯時基因上靶、脫靶導致的**和雜質殘留等。

       因此，應根據多方面因素，結合細胞終產品的特點，針 對不同類型基因修飾系統的特性進行風險評估和控制。例如， 根據風險評估情況，合理設計修飾系統的結構和序列，避免 使用致癌元件等高風險的元件，進行相關檢測，盡可能降低 同源重組和病毒載體回復突變的可能性；對高風險的生產原 材料進行質量控制，在適當的制備環(huán)節(jié)，設定過程控制的檢 測項目和驗收標準；根據修飾系統作用機理，針對基因序列 穩(wěn)定性等安全性相關的風險因素開展研究等。在細胞終產品 生命周期內對修飾系統進行跟蹤分析和更新，收集數據以進 一步確定其風險特征并制定控制策略。

       （二）不同生產使用情形的風險

       基因修飾系統在細胞治療產品生產過程中的使用情形可能不同，目前研究可能包括體外基因修飾后直接制備細胞產品（情形一）和體外基因修飾后建系/庫再制備細胞產品（情形二）兩種使用情形。兩種使用情形相應基因修飾系統的風險不同，其藥學研究的要求可能存在差異，需要具體問題具體分析。

       對于情形一，基因修飾系統建議在 GMP 的條件下制備， 該情形下所用的基因修飾系統與回輸人體的細胞直接接觸， 應關注該系統生產用原材料的質量控制、批次間的質量差異、雜質水平等可能影響細胞治療產品安全性、有效性的研究內 容。本指導原則后文主要論述該情形。

       對于情形二，基因修飾系統用于細胞系/庫的建立，其 序列的設計、生產用材料、制備工藝、質量、穩(wěn)定性、內包 材的要求可依具體情況，結合細胞系/庫的質量研究結果進 行綜合評估。由于基因修飾系統使用情況的復雜性（如一次 使用或多次使用），可結合生產使用情況和細胞系/庫的研究 和檢測情況，制定修飾系統的風險控制策略。良好的基因修 飾系統質量研究與控制有利于篩選、建立出質量良好的細胞 系/庫，有利于后續(xù)的生產研究。細胞系/庫建立過程中，建 議進行單克隆篩選，對細胞系/庫進行檢定和傳代穩(wěn)定性研 究，關注細胞系/庫功能是否符合理論設計和預期、安全是 否可控，必要時對細胞終產品進行基因修飾相應的質量研究， 以確認基因修飾系統的適用性。

       （三）變更風險

       隨著基因修飾技術不斷更新和研究經驗的逐步積累，研發(fā)過程常常伴隨基因修飾系統的升級和工藝的優(yōu)化，因此研發(fā)各階段基因修飾系統有可能發(fā)生變更。

       基因修飾系統變更可能顯著影響細胞產品的安全性和有效性，是細胞治療產品藥學研究的重要風險之一，研發(fā)者需評估變更引入的影響和風險。根據風險評估情況，對基因修飾系統及其細胞終產品（如適用）的質量、工藝控制、穩(wěn)定性等方面進行深入研究，合理設計變更可比性研究方案。

       五、基因修飾系統的設計、制備和質量控制

       （一）病毒載體類基因修飾系統

       1. 病毒載體的設計與構建

       1.1 目的基因及調控元件

       目的基因是基因修飾系統中實現預期功能的關鍵序列， 調控元件是影響目的基因序列轉錄、翻譯和穩(wěn)定性的重要序列。研發(fā)者應基于細胞終產品的安全性和有效性，結合風險評估，進行基因修飾系統各元件的設計與構建。

       目的基因：本文中是指基因修飾系統傳遞、表達的遺傳物質，研發(fā)者應結合其在疾病治療中的作用或作用機理謹慎選用和設計目的基因序列，關注目的基因的來源、序列篩選及優(yōu)化過程，明確完整的核苷酸、氨基酸（如適用）序列信息，并建議與數據庫收錄的相關序列進行序列比對。目的基因的優(yōu)化中，應闡述分子改構的科學評估及驗證研究考慮，如人源化改構，敲減元件，自殺標記，以及為調控高級結構形成或為適應載體大小進行的序列改造和刪減等。同時，建議結合目的基因或其表達產物與靶分子的特異性結合能力， 評估潛在的非特異性效應等?？梢越Y合目的基因序列特征、目的蛋白與細胞基因組的相互作用等，充分考慮目的基因對目的細胞基因組穩(wěn)定性的影響。如目的基因屬于非人源或改構的序列等，也可結合種屬間目的基因序列差異和表達產物的免疫特性，評估目的基因的免疫原性。

       調控元件：功能性元件對目的基因的轉錄和表達具有重 要調控作用，研發(fā)者應關注其設計原理并進行確認研究?？?以根據目的基因的表達量、預期作用和持續(xù)時間以及目的細 胞的類型等合理選擇和設計調控元件，相關的調控元件可能 包括信號肽、轉錄啟動子、增強子、終止子、隔離子、5’ 非翻譯區(qū)、3’非翻譯區(qū)、多聚腺苷酸信號區(qū)、內含子、其他 增強轉錄及翻譯效率相關元件、復制起始位點、額外引入的 基因序列等。各調控元件的序列來源及選擇依據應明確。例 如啟動子設計方面，建議結合目標細胞類型、目的基因表達 時間和表達量的需求、啟動子的人用經驗等分析其啟動子使 用的安全性，在風險評估的基礎上合理選用。調控元件設計 時需充分考慮元件的安全性和有效性，關注相關序列引入的 必要性和合理性，盡量避免使用高風險的元件，如必需使用， 應進行相關序列的安全性改構。對于序列改構或優(yōu)化的元件，均應明確序列更改的依據與安全性考慮。此外，還建議關注功能元件設計對細胞基因組內源性基因的干擾。

       1.2 病毒載體

       病毒載體通?？梢苑€(wěn)定、高效地轉導目的基因至目的細胞中發(fā)揮作用。病毒載體的選擇和設計可綜合考慮目的基因表達時間、表達量，病毒載體的致病性、整合能力、感染過程、轉導效率、細胞**以及細胞產品的細胞類型、作用機制、臨床適應癥、給藥方法等多方面。病毒載體的結構優(yōu)化策略包括提高病毒穩(wěn)定性、增強細胞轉導率、拓寬可轉導細胞類型等。

       目前常用的病毒載體通常進行了毒力、致病性或復制能力相關基因的刪除，以確保使用的安全性。設計中，應盡可能降低與野生型病毒相關的任何致病性，并盡可能將病毒重組和回復突變的風險降到最低。對于改構的病毒載體需關注親本病毒的來源、培養(yǎng)歷史和生物學特性等，對改構用材料、方法、步驟及鑒定進行充分研究。病毒載體進行改構時，不應引入新的安全風險。

       下面以目前研究中常見的病毒載體為例進行說明。

       1.2.1 γ-逆轉錄病毒載體（γ-Retroviral Vector）

       γ-逆轉錄病毒可逆轉錄其 RNA 基因組成為 DNA 拷貝， 病毒 DNA 隨機整合進入有絲分裂活躍的細胞基因組。目前， 體外基因修飾用 γ-逆轉錄病毒載體常見有鼠白血病病毒（Murine Leukaemia Viruses，MuLV），貓白血病病毒（Feline Leukaemia Virus，FeLV）和長臂猿白血病病毒（Gibbon Ape Leukaemia Virus，GALV）等載體。其基因設計與改造主要包括提高載體安全性和基因轉導有效性。

       γ-逆轉錄病毒載體可通過轉移質粒（含有目的基因）、 輔助質粒瞬轉細胞進行病毒載體包裝，也可通過整合了轉移 質粒序列、輔助包裝元件的穩(wěn)定產毒細胞系制備。為提升基 因修飾載體的安全性，建議對修飾系統進行優(yōu)化，例如使用 刪除了非必需元件、經充分改構、安全性級別較高的 γ-逆轉錄病毒載體，盡可能將病毒重組和回復突變的風險降到最低。具體優(yōu)化操作還可能包括使用異源啟動子和異源 polyA 信號表達輔助包裝元件、將輔助包裝元件拆分于不同質粒表達、改造長末端重復序列（Long terminal repeat，LTR）使得末端自失活（Self Inactivating, SIN）等方式。

       基因轉導有效性方面，鼓勵研發(fā)者對病毒載體包裝元件進行優(yōu)化，提高病毒載體包裝效率、結構穩(wěn)定性和轉導活性等，如將 γ-逆轉錄病毒載體的包膜蛋白替換為其他包膜蛋白以提高病毒穩(wěn)定性等。針對改造情況，需進行充分的研究與驗證。

       1.2.2 慢病毒載體（Lentiviral Vector）

       慢病毒載體通過介導目的基因整合至細胞基因組發(fā)揮作用，與 γ-逆轉錄病毒載體只能感染有絲分裂活躍的細胞不同，慢病毒載體能感染有絲分裂活躍和不活躍的細胞。目前， 體外基因修飾用慢病毒載體常見有人慢病毒、非人靈長類和非靈長類慢病毒等載體。使用非人靈長類和非靈長類慢病毒載體時建議關注產生重組病毒嵌合體和/或跨物種傳播的相關風險。慢病毒載體的設計與改造主要包括提高載體安全性和基因轉導有效性。

       慢病毒載體制備和臨床使用的主要風險點包括：產生復制型慢病毒（Replication-competent lentivirus，RCL），發(fā)生體內重組，以及在相關基因中或其附近插入前病毒 DNA 從而可能引起或促進腫瘤發(fā)生和其他細胞病變等。因此，慢病毒載體設計方面，建議采用所有可能降低慢病毒致病風險的措施，包括不同包裝基因分離于不同質粒表達（如 gag/pol 和 rev 分離），降低輔助質粒和轉移質粒間的序列同源性，刪除不必要的調控元件，改造 LTR 使得末端自失活等。對于轉移質粒，鼓勵進行序列優(yōu)化，提高安全性，如降低啟動子插入目的細胞引起原癌基因活化的幾率等。

       為了提高基因轉導有效性，可考慮采用替換包膜蛋白、提升定點整合能力等改造策略。例如，人類免疫缺陷病毒（HIV）衍生的慢病毒載體，可通過用編碼異源病毒包膜蛋白（如 VSV-G）的基因替換 HIV 包膜蛋白基因序列來制備以增強載體的親嗜性和穩(wěn)定性。通過對整合酶和 LTR 等序列進行改造，提升慢病毒載體的定點整合性能。對載體改造的同時，建議關注病毒載體穩(wěn)定性的變化、整合位點的偏好性等可能引入的風險。

       1.2.3 仙臺病毒載體（Sendai Viral Vector）

       仙臺病毒載體是在細胞質表達目的基因，通常不整合于細胞基因組中的單鏈反義 RNA 病毒載體。目前有研究將其應用于細胞重編程建立誘導多能干細胞系（iPSC）的過程中。設計和構建時，在穩(wěn)定表達目的基因的同時，為防止產生具有復制能力的病毒顆粒，可考慮刪除或改構病毒組裝相關蛋白，例如參與病毒組裝的核衣殼結構蛋白以及基質蛋白等。為確保有效地控制 iPSC 中仙臺病毒載體的殘留量，可以考慮改構復制相關元件，例如通過 RNA 聚合酶的突變等方式， 構建具有溫度依賴型復制能力的仙臺病毒載體；同時，需建立相關方法檢測和驗證仙臺病毒載體在 iPSC 克隆中是否殘留以控制風險。

       其他病毒載體還可能包括腺病毒、腺相關病毒等載體， 其分子設計和構建可以結合特定病毒結構、目的基因序列特征、包裝序列的安全性等綜合考慮?；驹瓌t可參考上述內容。

       2. 生產用物料

       2.1 質粒

       對于采用多個質粒瞬時共轉染方式制備的病毒載體，需根據風險、結合載體特性等，開展相應的質粒設計構建、生產工藝、質量控制和穩(wěn)定性等研究。

       設計和構建：根據研究，選擇合理的質粒骨架、質粒復制起始點、啟動子以及選擇性標記等組成元件，刪除非必需元件（特別是致癌等風險較高的序列），并完整確認質粒的核苷酸序列。質粒構建時一般應避免使用 β-內酰胺類抗生素抗性基因，且質粒設計時建議最 大 程 度防止抗性基因序列插入病毒載體基因組中，鼓勵開發(fā)研究采用非抗性基因篩選的質粒。采用額外的增強轉錄或翻譯的元件時，應充分評估其功能性和安全性，在必要時，進行相應的安全性改造，如土撥鼠肝炎病毒轉錄后調控元件（Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element, WPRE）等。建議盡可能將不同包裝元件拆分于多個質粒進行表達，以降低同源重組發(fā)生的概率。

       生產工藝：根據工藝研究情況，通過對關鍵工藝參數的探索和優(yōu)化，確定穩(wěn)定的質粒規(guī)?；a工藝，生產工藝應有明確的生產規(guī)模、工藝流程、工藝步驟的詳細描述以及過程控制策略等。質粒生產過程中應盡量避免使用人源和動物源性材料，避免使用 β-內酰胺類抗生素，如需使用其他種類的抗生素，應對抗生素的殘留量進行控制和安全性評估?；谘邪l(fā)階段和風險評估，開展質粒工藝驗證或確認研究，如工藝過程控制確認、中間產物貯存穩(wěn)定性研究、多批次質量分析以及雜質清除研究等。

       質量控制：需建立合理的質量標準并進行放行檢驗。質粒放行的質控項目一般包括：pH 值、外觀、鑒別（限制性內切酶分析和測序）、質粒濃度 / 含量、純度與雜質（A260/A280、超螺旋比例、宿主菌 DNA 殘留、宿主菌 RNA 殘留、宿主蛋白殘留、抗生素殘留（如適用））、無菌及細菌內毒素等。

       穩(wěn)定性研究：選擇合理、敏感的考察項目（如超螺旋比例等）進行穩(wěn)定性監(jiān)測，根據研究結果制定合理的貯存條件和有效期。

       2.2 細菌種子批

       本指導原則細菌種子批指通過將病毒包裝質粒轉化宿主菌，經單克隆篩選及培養(yǎng)傳代后建立的種子庫。對于選用的宿主菌，需充分考慮宿主菌的來源、基因型、表型、既往使用經驗和生產需求等因素，如使用新型菌株，需關注其可能引入的額外風險。

       細菌種子批的建立：根據研究建立各級細菌種子批，明確制備規(guī)模、擴增條件、貯存條件等。研究中關注目標克隆篩選的情況，關注用于生成種子批的材料的來源、生產過程等以評估分析安全性風險。

       細菌種子批的質量控制：建立適宜的放行檢測項目、標準和檢測方法。檢測項目一般包括細菌形態(tài)學鑒別、染色鏡檢、生化特性分析、抗性檢查、質粒限制酶切圖譜分析、目的基因和其他元件序列準確性分析等。檢測方法需經過研究確認和/或驗證。通過質量控制應確保不存在其它細菌、真菌和噬菌體的污染，以及確保目的基因序列和其他元件序列的準確性。

       細菌種子批穩(wěn)定性研究：傳代穩(wěn)定性一般包括質粒大小、質粒序列準確性、質粒限制酶切圖譜、質粒保有率、質?？?貝數等，根據研究結果明確種子批的限定傳代代次。貯存穩(wěn) 定性建議關注在貯存條件下和時長內種子批的活率等。

       2.3 生產/包裝細胞庫

       病毒載體制備涉及的細胞基質包括包裝病毒載體用細胞基質和可以穩(wěn)定產生病毒載體的細胞基質。選擇細胞基質時，需要考慮病毒載體包裝和制備的可行性，結合細胞來源（包括物種來源）、生長特性和載體制備能力，以及可能影 響最終產品安全性的細胞特征等，選擇適合的細胞基質。風 險評估時，要充分考慮細胞基質中是否存在內源性病毒顆粒、致癌序列等。對于新建立的細胞基質或具有相應風險的細胞基質（如腫瘤細胞來源的細胞），適用的情況下應評估細胞 的成瘤性和致瘤性。有些情況下，需要對細胞基質進行修飾（例如插入特定病毒蛋白表達序列允許病毒復制或包裝），研究中應該關注修飾后細胞的遺傳、表觀和生長等特性以及病毒載體制備情況等。細胞基質選定和/或修飾后需建立細胞庫，以確保生產的穩(wěn)定性和一致性?？蓞⒄铡吨袊幍洹贰CH Q5A、ICH Q5D 等相關要求對細胞庫進行檢定。檢測項目需根據風險評估確定，至少包括鑒別、無菌、支原體、螺原體（昆蟲細胞）以及內、外源病毒因子、種屬特異性病毒等。開展細胞庫傳代穩(wěn)定性研究，包括細胞生長穩(wěn)定性、遺傳穩(wěn)定性、病毒載體包裝能力穩(wěn)定性等，建議研究中納入病毒載體的生產終末細胞或平行生產的對照細胞，擬定適合病毒載體制備的細胞限傳代次。

       包裝病毒載體用細胞庫：細胞庫細胞經擴增、質粒轉染后合成病毒載體基因序列、表達載體蛋白，并最終形成病毒載體顆粒。例如，目前慢病毒載體包裝常見使用 HEK293T 細胞，轉入該細胞的質粒 LTR 之間的 DNA 片段被轉錄成RNA，由輔助質粒表達的蛋白將其包裝形成病毒載體顆粒。需要關注的是，當病毒載體與非載體 DNA 序列（如質粒DNA、輔助病毒序列、細胞 DNA 等）共同包裝時，非載體DNA 序列可能與病毒載體同源重組，或其殘留可能產生致癌風險，建議開展風險分析與研究，評估細胞基質選用的合理性。例如使用含有腺病毒 E1、SV40LT 抗原等風險元件的細胞基質包裝慢病毒載體時，應關注載體中腺病毒 E1 和SV40LT 抗原序列的殘留量。

       可以穩(wěn)定產生病毒載體的細胞庫：細胞基質經基因修飾、篩選、建庫后可穩(wěn)定表達或產生病毒包裝用蛋白或元件，完 成病毒包裝和制備。例如，γ-逆轉錄病毒載體制備常見使用小鼠 PG13、HEK293-Phoenix 細胞等，生產用細胞需穩(wěn)定表達 gag-pol、包膜蛋白、目的基因等。構建過程中建議關注其病毒包裝效率和所產病毒載體的質量，并降低內、外源因子污染和復制型病毒產生等安全性風險。穩(wěn)定產毒細胞系需經過基因修飾并通過單克隆篩選獲得，獲得的單克隆細胞系需建立細胞庫，并進行全面的檢定。同時，開展細胞傳代穩(wěn)定性研究，關注不同代次穩(wěn)定產毒細胞中插入基因片段的遺傳穩(wěn)定性以及病毒載體的產量和質量等。

       2.4 病毒種子批

       通過病毒種子制備病毒載體或者輔助病毒的，需建立病毒種子批。病毒種子的來源、歷史培養(yǎng)情況等需清晰明確， 且風險可控。對于培養(yǎng)歷史不清晰，存在其他病毒污染風險， 或毒株單克隆性無法確認的病毒種子，不建議使用，如確需使用，可以在構建過程中進行多輪噬斑純化、有限稀釋純化或通過 DNA/RNA 克隆拯救等，以確保毒株的純度和單克隆性。

       種子批的建立過程、代次、貯存和維護等信息應清晰、明確；如有，應說明種子批制備過程使用的人源/動物源材料，并進行安全性評估。

       病毒種子批應經過充分檢測，檢測項目建議包括：無菌、支原體以及外源病毒因子、病毒載體和目的基因的鑒別與測序、病毒滴度或濃度、生物學活性、雜質、對抗病毒 藥物的敏感性（如適用）、回復突變（如適用）等。建議對病毒種子批進行全基因測序，并對測序結果與預期序列進行對比分析，如有，需對所有差異進行評估。對于序列較長的病毒載體，建議最 大 程 度進行序列分析，所分析的序列建議包括基因插入片段、側翼區(qū)域以及載體中被修飾或可能易于重組的區(qū)域。

       病毒種子批需開展全面的傳代穩(wěn)定性研究，研究過程應能代表或模擬實際制備工藝，研究中關注病毒種子批的遺傳穩(wěn)定性和生產穩(wěn)定性等。根據研究，制定病毒種子批的限定傳代代次。

       如病毒載體制備過程使用了輔助病毒，應開展充分的研究說明輔助病毒使用的必要性和選擇依據，結合科學認知及生產經驗說明輔助病毒的安全性。輔助病毒的設計構建、建庫、生產制備和檢定建議參考上述病毒種子批的一般要求。

       2.5 其他生產用物料

       其他生產用物料包括原材料（如試劑、培養(yǎng)基等）、耗材、培養(yǎng)容器等。結合工藝研究，選用適宜的生產用原材料， 制定合理的原材料質量控制標準，進行嚴格的供應商審計， 明確生產用原材料的來源、組分、功能、使用階段、質量標準等。制備過程中盡量避免使用人或動物來源的成分，如果確需使用，可參考《中國藥典》相關規(guī)定和/或 ICH Q5A 等指南開展外源因子等安全性相關的風險評估與研究。需要重點關注的原材料包括：用于細胞培養(yǎng)的人或動物源材料（如牛血清、消化酶），質粒轉染試劑（如聚乙烯亞胺、陽離子脂質等），核酸酶等。對于病毒載體制備或貯存時使用的人血白蛋白等風險較高的制品，建議盡可能選用經監(jiān)管部門批準，并符合國家相關技術要求和管理規(guī)范的產品。對于耗材和培養(yǎng)容器，建議經過分析和研究，評估其適用性，盡量降低病毒載體制備過程中的安全性風險。

       3. 制備工藝

       病毒載體的制備工藝是指從生產用細胞的復蘇擴增、病毒載體的收獲到病毒載體灌裝、貯存（如有）的全過程。對于體外基因修飾后直接制備細胞產品的病毒載體系統，由于病毒載體質量可直接影響終產品質量，因此其制備工藝研究應更加充分完善。在對整體工藝的充分理解和對病毒載體質量的累積經驗基礎上制定制備工藝，建立規(guī)范的工藝操作步驟、工藝控制參數和廢棄標準，并明確關鍵工藝參數。制備工藝應適用于確保細胞產品符合對應開發(fā)階段的質量目標產品概況的要求。另外，還應采取措施避免病毒載體在制備、貯存、運輸的整個過程中發(fā)生混淆、污染與交叉污染等。

       3.1 制備規(guī)模和批次定義

       不同類型病毒載體的生產用細胞類型、生長特性、病毒載體產量和穩(wěn)定性等存在較大差異，制備工藝成熟程度及病毒載體使用量等也不盡相同，建議結合待基因修飾細胞的特性、病毒載體的工藝和臨床使用需求等，合理確定病毒載體的制備規(guī)模。病毒載體制備規(guī)模需與細胞終產品研究階段（臨床試驗、商業(yè)化制備）相適應。工藝中可能包括生產用細胞培養(yǎng)、質粒轉染或病毒感染、收獲、純化等步驟，制備過程中的上、下游工藝規(guī)模需盡量匹配且合理。對于較小的規(guī)模，建議關注不同批次間的質量一致性。

       根據病毒載體工藝特點，制定批次定義和編號規(guī)則。如有需要，可明確制備過程中不同工藝步驟，特別關注如有分批和合批的操作步驟時的批次定義和編號規(guī)則。確保病毒載體批次的可追溯性。

       3.2 工藝研究與開發(fā)

       用于制備病毒載體的工藝有多種，包括通過質粒 DNA 瞬時轉染包裝細胞基質制備，通過穩(wěn)定的生產用細胞系制備， 或通過病毒種子感染細胞基質制備。

       鼓勵結合質量源于設計和全過程控制等新理念，以及對 相關風險控制的一般要求開展工藝研究。隨著生產經驗的積 累和質量屬性認識的加深，不斷優(yōu)化工藝，最終完成實驗室 工藝到商業(yè)化規(guī)模工藝的轉化。制備工藝一般可以分為上游、下游兩個階段，即上游病毒載體收獲階段和下游病毒載體純 化階段。制備過程中的生產用細胞種類、細胞培養(yǎng)條件、轉 染或感染條件、收獲時間、純化步驟及貯存條件等均會影響 病毒載體的包裝效率和質量。研究中需對工藝步驟、關鍵工藝參數及其控制范圍進行研究、確認或驗證，并建立相應的過程控制標準。例如，復制型病毒（Replication competent virus, RCV）是過程控制中的安全性風險關注點之一，應根據病毒載體種類、工藝特點等開展風險評估，在制備過程中選擇合理的檢測點（如病毒載體收獲液、生產終末期細胞或純化后的病毒載體原液等），采用經驗證的方法開展檢測。另外，基于風險，結合病毒對于理化條件的耐受性，必要時， 還需根據生產用細胞類型、輔助病毒使用、純化工藝特點等建立相應的病毒去除/滅活步驟并進行充分的驗證。

       下文以 γ-逆轉錄病毒載體和慢病毒載體為例分別對穩(wěn)定產毒和質粒轉染兩種制備工藝進行介紹。其他病毒載體和其他制備方式，如適用，也可參考。

       3.2.1 穩(wěn)定產毒制備工藝研究

       （1）制備

       以 γ-逆轉錄病毒載體為例，制備時其由穩(wěn)定產毒細胞分 泌至培養(yǎng)液中，可經過澄清過濾等步驟純化獲得病毒載體。建議根據病毒載體的結構特性、包裝機制、穩(wěn)定性等制定合 理的工藝步驟和參數，關注制備過程中的細胞培養(yǎng)體積、接 種密度、培養(yǎng)條件、收獲時間等。例如，有報道稱由于 γ- 逆轉錄病毒載體的一些包膜蛋白在通常細胞培養(yǎng)條件（37℃） 下的穩(wěn)定性較弱，針對該情況建議開展研究，制定相應的病 毒制備和收獲策略，以確保病毒載體的活性和回收率。

       （2）純化

       根據 γ-逆轉錄病毒載體的結構特點、宿主細胞的種類、雜質殘留的成分等,設計合理的純化工藝，以提高病毒載體的純度，降低雜質殘留的安全性風險。

       例如，某些病毒載體的包膜蛋白可能對層析工藝比較敏感（如剪切力），因此，鼓勵開發(fā)先進的純化工藝，在滿足病毒載體結構穩(wěn)定性和功能活性的基礎上，盡可能提高病毒載體的純度，實現病毒載體的規(guī)?；兓?。

       3.2.2 質粒轉染制備工藝研究

       （1）包裝與制備

       以慢病毒載體為例，用于質粒轉染的病毒包裝細胞通常 采用貼壁或懸浮方式培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)方式建議根據規(guī)模、制 備工藝設計和質量研究等選擇以滿足商業(yè)化制備的需求。病 毒包裝工藝的研究包括對質粒濃度、質粒比例、轉染試劑及 濃度、誘導試劑濃度（如有）、轉染時間、細胞密度、細胞 培養(yǎng)基組分、細胞培養(yǎng)環(huán)境（溫度、pH、溶氧）、收獲時間、 收獲次數等參數的優(yōu)化。根據研究，確認工藝步驟、關鍵工 藝參數及其控制范圍，并建立相應的過程控制標準。例如在 細胞培養(yǎng)過程中定期檢測細胞活率和生物負荷，開展載體滴 度、支原體和外源性病毒等檢測，并進行復制型慢病毒（RCL） 檢測等。載體收獲液如需貯存，需開展相應的研究以確認貯 存條件、貯存方式等。對于外源因子檢測，建議盡量提高檢測方法的靈敏度，在適宜的檢測點（如外源因子富集的階段） 進行檢測。

       （2）純化

       目前，慢病毒載體的純化工藝通常采用核酸內切酶去除附在病毒載體表面的大片段核酸雜質，經澄清、過濾及離子層析或分子排阻色譜等純化步驟進行雜質的去除，最后經制劑、除菌過濾、灌裝制成病毒載體以備使用。根據研究，純化工藝可以進行適當的調整和優(yōu)化，研究確定各純化工藝步驟以達到去除雜質，純化病毒的目的。如適用，工藝研究中建議對核酸酶濃度、純化方式、介質選擇、動態(tài)載量、流速、回收率、病毒載體貯存條件、灌裝工藝參數等進行研究，并對核酸酶殘留、BSA 殘留、風險元件殘留（如腺病毒 E1 和SV40LT 抗原序列殘留）、質粒 DNA 殘留、宿主蛋白殘留、宿主 DNA 殘留及轉染試劑殘留等雜質的去除率進行研究。純化工藝過程中需加強過程控制檢測或質量研究，如生物負荷、內毒素、物理滴度、轉導滴度等。

       3.3 工藝驗證

       制備工藝鎖定后需開展工藝驗證以對各步驟的工藝進行確認，如適用，可以包括細胞擴增和載體制備各個步驟的驗證、中間產物貯存條件和時間驗證、雜質清除驗證、培養(yǎng)基模擬灌裝驗證、層析柱和超濾膜循環(huán)使用次數和除菌濾器的驗證以及運輸驗證等。通過工藝驗證證明制備工藝及其在設定的工藝參數范圍內可持續(xù)、穩(wěn)定的開展生產，病毒載體 的產量和回收率應相對穩(wěn)定，對殘留的核酸酶、宿主細胞蛋 白、宿主細胞 DNA、質粒 DNA、細胞碎片、轉染試劑等雜質，應有效清除至低于質量標準范圍或經過驗證研究的水平。

       鼓勵建立上、下游規(guī)模匹配的制備工藝，如果在制備過程中出現合批和/或分批的情況，需結合實際制備情況進行充分的研究驗證，根據研究結果制定合批和/或分批的原則及具體操作規(guī)范。用于合批的樣品在合批前應經過檢驗確認為合格樣品。

       4. 質量研究與質量標準

       4.1 質量研究

       鼓勵運用先進的分析方法，多角度、多層面地開展質量研究。分析方法需經過研究和確認，確保結果的準確、可靠。一般建議采用多個代表性批次開展質量研究，常見的研究項目包括外觀、病毒載體形態(tài)、鑒別、整合特征（如適用）、病毒載體滴度、生物學活性、純度、雜質（如復制型病毒、風險元件殘留、外源因子）等。根據研究結果，確定關鍵質量屬性。

       4.1.1 鑒別與序列確認

       可從病毒載體的整體水平、蛋白水平和核酸水平進行檢測。整體水平方面，可采用電子顯微鏡觀察、免疫血清學等方法分析鑒別。蛋白水平方面，可采用蛋白質電泳、免疫印跡等分析方法對載體的結構蛋白、表達產物、蛋白表達譜、免疫標記、表型特征等開展分析。核酸水平方面，建議對病毒載體進行全基因組測序以確認序列。需特別關注目的基因及調控元件序列的完整分析，對比分析測定序列與預期序列的一致性。對于整合型病毒載體，也可將病毒載體轉導目的細胞后，對整合有載體序列的細胞基因組進行測序，驗證載體骨架及目的基因序列的準確性。另外，還可采用限制性酶切圖譜分析、聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction， PCR）等方法對病毒載體和目的基因進行鑒別。鑒別試驗應設置合適的陽性和陰性對照。

       4.1.2 整合特征

       對于整合型病毒載體，建議選用適用的方法，研究載體整合至目的細胞基因組的典型特征，包括優(yōu)勢插入位點、插入拷貝數、優(yōu)勢克隆異常生長等。關注是否存在病毒載體優(yōu)先整合至目的細胞基因組癌基因附近的情況及其他潛在的致癌風險。

       4.1.3 病毒載體滴度

       滴度是病毒載體生物學活性和含量的重要檢測項目，可用于工藝過程監(jiān)控和放行檢測，需選擇靈敏度、準確度、精密度等符合要求的檢測方法開展研究。鼓勵采用多種方法進行滴度的檢測，并探索不同方法檢測數值的相關性。滴度檢測包括物理滴度（病毒載體總顆粒數）和轉導滴度（病毒載體感染性顆粒數）。研究中需使用標準品或對照品來校準滴度檢測結果?？梢酝ㄟ^病毒載體中感染性顆粒與總顆粒的比例，用于比較不同批次之間和載體制備的不同階段之間的質量特征。

       物理滴度：載體特定蛋白/核酸的定量可用于載體顆粒數量（物理滴度）的估計。例如，HIV-1 衍生的慢病毒載體， 常用酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測載體樣本中的 p24 蛋白從而進行物理滴度的檢測，檢測結果可以 p24 蛋白含量/ml 或顆粒數/ml 表示，檢測時應關注游離 p24 蛋白對結果的影響。此外，載體基因組拷貝數的定量也可用于物理滴度的估計，檢測時建議關注外源 DNA 的干擾。若采用新技術檢測，如病毒計數儀法、納米顆粒跟蹤分析法、場流分離- 多角度激光光散射法等，建議關注方法對待測病毒載體類型的適用性。

       轉導滴度：可使用基于細胞的體外檢測方法檢測病毒載體的感染能力。通常待測病毒載體感染細胞一定時間后，通過細胞基因組定量 PCR、流式細胞術、組織/細胞病變或形成噬斑等方法檢測，計算出病毒載體的轉導滴度，檢測結果通常以轉導單位（TU/ml）、半數組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）或噬斑形成單位（PFU）等表示。

       4.1.4 生物學活性

       一般指將目的基因轉移到目的細胞的能力以及目的基因表達產物的生物學效應，其中基因轉移能力也與病毒載體的轉導滴度相關。生物學活性研究貫穿在整體研究開發(fā)過程中，建議在研發(fā)早期建立生物學活性檢測方法；上市階段， 建議根據載體的作用機制和質量屬性，盡可能確定與實現預期功能（替代、補償、阻斷、修正特定基因作用等）相關的生物學活性檢測方法，必要時，建立合適的標準品。由于病毒載體的生物學活性發(fā)揮可能在細胞終產品中體現，因此， 也可以結合終產品的生物學活性綜合評價病毒載體的生物學活性。

       4.1.5 純度和雜質

       （1） 載體相關雜質：與病毒載體相關的典型雜質可能包括錯誤包裝顆粒、缺陷干擾顆粒、非感染性顆粒、空衣殼顆粒、聚集體或復制型病毒等，建議采用適用的方法，例如高效液相色譜、電泳法、毛細管電泳法、紫外吸收光譜法等進行研究。通過病毒載體中總顆粒與感染性顆粒的比例，也可以反映病毒載體的純度和雜質情況。另外，在核酸水平， 可以考慮鑒定具有缺失、重排、雜交或突變序列的載體等相關雜質，以含量比率的形式報告檢測數值，必要時應納入質量標準。

       （2） 復制型病毒的檢測：采用復制缺陷型或條件復制型病毒載體時，需在工藝的適當階段檢測制備過程中可能產生的具有復制能力的病毒，并根據細胞終產品給藥劑量、病毒載體風險等確定殘留量的標準限度。復制型病毒與產品的 安全性相關，需參考相關研究經驗或文獻，研究并建立靈敏 的檢測方法。常見的檢測方法包括指示細胞培養(yǎng)法、直接qPCR 法等。待測樣品包括病毒載體制備過程中收獲的病毒載體收獲液、生產終末細胞和細胞終產品等。方法開發(fā)時， 需關注各檢測方法對應的操作流程、樣本量、陰性對照、陽 性對照、檢測標志物、檢測限、判定標準等方面的設定和驗 證研究。建議根據所用病毒包裝系統設計特異的檢測標志物， 如適用，研究中鼓勵同時采取兩種以上基于不同原理或針對 不同標志物的檢測方法，從而提高復制型病毒的檢出率。當 采用指示細胞培養(yǎng)法時，需選擇合理的擴增細胞和指示細胞， 并應考慮待檢樣本對指示細胞生長的抑制作用等，研究、設 置合理的待測樣本滴度范圍，并建議設置干擾組對照。

       復制型逆轉錄病毒（RCR）檢測：根據目前的研究技術水平，建議采用敏感的指示細胞培養(yǎng)法對γ-逆轉錄病毒載體進行 RCR 檢測。RCR 擴增細胞與待測樣本進行共培養(yǎng)以最 大 程 度擴增 RCR，在一定傳代次數和時間的傳代培養(yǎng)后取適量上清接種 RCR 指示細胞培養(yǎng)，以觀察、計數細胞病變集落或者進行 RCR 標志物的檢測。

       復制型慢病毒（RCL）檢測：根據目前的研究技術水平，建議采用指示細胞培養(yǎng)法對慢病毒載體進行 RCL 檢測。對于 HIV 衍生的慢病毒載體，其 RCL 檢測所用陽性對照可考慮使用滿足檢測要求的 HIV 病毒，如缺乏輔助基因的，同時具有復制能力的病毒，研究并評估陽性對照病毒的結構和制備方法，并在符合要求的環(huán)境中妥善操作和使用。RCL 檢測指標方面，通常認為 p24 蛋白、逆轉錄酶活性、psi-gag 和 VSV-G 序列等的檢出可反映 RCL 的存在，結合病毒載體具體情況和研究情況，選擇合適的檢測指標。

       （3） 工藝相關雜質：可能包括殘留宿主細胞蛋白、非目的核酸序列、輔助病毒污染物（如傳染性病毒、病毒 DNA、病毒蛋白等）和工藝中所使用的試劑殘留，例如細胞因子、生長因子、抗體、轉染試劑、磁珠、核酸酶、血清和溶劑等。

       以非目的 DNA 殘留為例，其可能包括與病毒載體共純化的殘留宿主 DNA、質粒 DNA 等，是常見的工藝相關雜質。包裝過程中病毒載體的衣殼內部也可能共包裝非目的 DNA， 這些雜質可能對產品質量和安全性產生不利影響，建議優(yōu)化 工藝，以減少其污染。必要時，對殘留的非目的 DNA 序列進行確認和含量的監(jiān)測。當生產/包裝細胞為腫瘤來源的細 胞、致瘤細胞系或攜帶有致癌基因序列等需要高度關注的細 胞時，在優(yōu)化工藝、降低其殘留的基礎上，還建議控制非目的 DNA 片段大小（建議在 200bp 以下），并對已知的高風 險基因進行專項監(jiān)測。例如，采用HEK293T 細胞進行慢病毒載體制備時，需采用具有足夠的靈敏度和特異性的方法檢 測腺病毒 E1 和 SV40LT 抗原序列的殘留。

       4.1.6 其他

       微生物污染物：檢測可能引入的污染物，包括外源病毒、細菌、真菌、支原體、細菌內毒素等。

       理化檢測：常規(guī)的理化檢測項目可能包括外觀（顏色、透明度）、可見異物、不溶性微粒、pH、含量、滲透壓等。

       4.2 質量標準

       質量標準是質量控制的重要部分，包括檢測項目、檢測用方法學和各檢測指標的可接受標準。檢測階段一般包括放行檢測和/或過程控制等。

       根據現有研究認知，病毒載體的質量標準檢測項目通常包括外觀、鑒別、純度、含量/滴度、生物學活性、雜質、無菌性、細菌內毒素、支原體和外源病毒因子等。檢測用方法需經過研究與驗證以確保檢測結果可靠和準確。如適用， 盡量建立對照品/標準品，并對其開展相應的質量研究、含量/活性的標定、確定貯存條件等。一般情況下，可接受標準的制定依據包括產品質量設計、質量研究、工藝開發(fā)、驗證研究、方法學研究與驗證、多批檢測和穩(wěn)定性結果，以及合理的統計學方法等。

       （二）非病毒載體類基因修飾系統

       非病毒載體類基因修飾系統可通過物理、化學或生物轉導方式遞送進入細胞。進入目的細胞后，通過轉錄、剪切、翻譯等方式發(fā)揮作用，其活性組分為DNA、RNA 或蛋白質，也可能為核酸與蛋白質組分的組合。

       1. 分子設計

       非病毒載體類基因修飾系統的設計影響目的基因修飾或目的基因表達的特異性、準確性和有效性，也影響基因修飾細胞終產品的安全性和有效性，構建時需要對設計和改構的利弊進行權衡分析。

       對于 DNA 類基因修飾系統，開發(fā)過程中需關注基因轉導效率、脫靶效率、插入突變情況、目的基因在目的細胞中的整合位點及拷貝數等。采用的設計策略包括基因密碼子優(yōu)化、染色體同源序列的改構、富含 GC 區(qū)序列的改構、信號肽以及合理啟動子的應用等。目前體外基因修飾常用的環(huán)狀DNA 類基因修飾系統，包括質粒、微環(huán)（Minicircle）DNA、納米質粒（Nanoplasmid）等不同類型。不同類型環(huán)狀 DNA 的選擇可重點關注高純度載體制備的難易程度、載體重組、細菌來源 DNA 序列在目標細胞內的表觀遺傳修飾對目的基因表達的影響等。此外，環(huán)狀 DNA 類基因修飾系統內可引入特殊的 DNA 片段，形成游離型載體，如引入 EBV 來源的順式作用 DNA 片段OriP 和反式作用的EBNA1 基因的載體，此類載體需關注種屬、細胞類型對游離型載體功能的影響，載體重組、順式/反式作用 DNA 片段對目的基因表達的影響等。

       對于 RNA 類基因修飾系統，以 mRNA 為例，根據目前的研究進展，考慮到設計對 RNA 的穩(wěn)定性和其在目的細胞內的生物學活性等可能具有顯著影響，構建時可以關注堿基修飾類型和比例、5’-帽或帽類似物結構、非翻譯區(qū)序列、Poly（A）加尾結構和自擴增元件（如有）等，并同時進行密碼子優(yōu)化、調控堿基間作用力及高級結構等方面的改造， 以實現預期的功能。

       對于基因編輯系統，建議對靶向序列、目的基因序列（如有）和基因編輯用酶等的序列和比例等進行優(yōu)化。通過特定細胞中的基因編輯效果確認基因編輯用酶和靶向序列的特異性，篩選最 佳的靶向結合序列（如 sgRNA 序列），并采取措施降低基因脫靶、插入突變的概率及對目的細胞基因組穩(wěn)定性的不良影響。對于轉座子系統，建議考慮整合位點的特異性和分布趨勢， 以及轉座子在基因組中的移動 （genomicmobilization）等特征，進行轉座子序列、轉座酶及相應調控元件的優(yōu)化，合理設置轉座序列/轉座酶的比例、序列分布等。

       2. 生產用物料

       基本原則可參考病毒載體類基因修飾系統部分的相關要求。

       對于采用重組技術或生物/化學合成技術制備的生產用原材料，需明確工藝和質量控制情況，特別是需要分析生產過程中可能引入的安全性相關雜質。對于制備過程中使用的酶類試劑，建議重點關注酶的功能活性，例如需關注所用DNA 聚合酶、RNA 聚合酶的保真度和活性，消化酶的酶解作用、酶的非特異性消化條件等，同時需要關注酶的純度、生產過程中引入的雜質等。對于核苷酸、5’-帽或帽類似物等原材料，其整體的質量應符合制備的要求，建議關注鑒別、濃度、純度和雜質等。制備過程建議避免使用氯化銫、溴化乙錠、氯仿等**物質，避免使用動物源胰蛋白胨、核酸酶等可能引入外源因子等風險的原材料。

       對于用作遞送系統的材料，其制備涉及的關鍵原材料（脂質、陽離子聚合物等）需進行充分的篩選和質量控制。

       3. 制備工藝

       基本要求同病毒載體類基因修飾系統。對于體外基因修飾后直接制備細胞產品的情況，需要多次、規(guī)?；闹苽?， 具體情況介紹如下。

       3.1 DNA 類基因修飾系統

       以質粒 DNA 為例，其制備步驟一般包括微生物培養(yǎng)及發(fā)酵、菌體收集、菌體裂解、質粒純化、濃縮、灌裝等。工藝研究與確定過程需對關鍵工藝參數進行探索和優(yōu)化，建立穩(wěn)定的制備工藝。關鍵工藝參數可能包括發(fā)酵培養(yǎng)基組成、發(fā)酵培養(yǎng)溫度、補料培養(yǎng)基組成、補料時間和補料量、溶氧量、堿裂解緩沖液及中和緩沖液的組成、堿裂解時間、層析柱載量、層析流速等。研究中建議關注制備全過程對質粒結構和功能可能的影響，如堿裂解步驟可能產生的質粒不可逆變性的情況等。純化工藝開發(fā)過程中，可以根據質粒的實際大小和性質選擇合適的柱層析填料，最 大 程 度去除宿主RNA、宿主 DNA、DNA 碎片和細菌內毒素等雜質。根據研究，設置合理的過程控制指標和可接受標準，如質粒中間產物的濃度、超螺旋比例、雜質殘留量等。

       3.2 RNA 類基因修飾系統

       基于研究現狀，RNA 的制備一般包括體外化學合成和DNA 轉錄兩種工藝路線。體外化學合成工藝請參考化學藥物的相關技術指南。DNA 轉錄工藝路線以 mRNA 的制備工藝為例，該工藝一般采用 DNA 轉錄模板進行 mRNA 體外轉錄、mRNA 加帽、去磷酸化、DNA 酶處理、mRNA 純化等步驟。建議對工藝參數進行研究與優(yōu)化，開發(fā)穩(wěn)健的工藝， 確保 mRNA 序列正確性、結構完整性、生物學活性和不同批次間質量的一致性。對工藝中引入的潛在雜質進行研究， 明確雜質的來源、去除步驟和去除能力等。工藝研究中需對關鍵工藝參數及控制范圍進行確認，如 NTP 濃度、轉錄時間、反應溫度、加帽反應物料投料比、層析介質、動態(tài)載量等，關注產品回收率、雜質去除率、加帽率、poly（A）長度及分布（如適用）、mRNA 片段的完整性以及序列的準確性等方面。制備過程中需設置合理的過程控制指標，如mRNA 濃度、雙鏈 mRNA 含量、不完整 mRNA 含量、殘留DNA、無菌、細菌內毒素等。

       3.3 其他

       基因修飾系統如含有重組蛋白質成分，根據具體情況， 可以參考重組蛋白質類生物制品生產的相關技術要求。

       4. 質量研究與質量標準

       4.1 質量研究

       質量研究通常包括鑒別、結構特征、理化特性、生物學活性、純度和雜質分析等。研究中建議采用多個代表性批次開展研究。如含有化學合成的組分和/或重組蛋白組分的， 可參考相關指導原則等開展質量研究。

       鑒別和序列確認：鑒別研究中，可采用限制性內切酶進行酶切，對酶切產物進行電泳分析，觀察是否存在特征性的帶型；也可以用 PCR 方法進行擴增，分析片段大小是否與理論大小一致等方法。對于 RNA，可將其逆轉錄為 DNA 后，采用上述方法進行鑒別，或考慮采用其他適用的方法。序列確認研究中，建議開展全序列測定，重點關注目的基因和調控元件的序列正確性，對于 RNA, 如有，建議同時關注 poly（A）序列的正確性。

       結構：建議采用適用的方法對結構完整性和大小均一性進行研究。如對于 DNA，可關注其是否存在單鏈、雙鏈、線性/開環(huán)、環(huán)狀和超螺旋等多種結構形式，以及可能的高級結構等；對于 mRNA，可關注其不同區(qū)域結構的完整性（如 5’-帽或帽類似物結構、poly（A）長度）、堿基修飾結構、去磷酸化程度以及可能的高級結構（如莖環(huán)結構）等。若功能活性與高級結構相關，建議分析研究高級結構特征。對于復合核酸類基因修飾系統，建議開展結構分析，如關注復合結構的粒徑大小、粒度分布、顆粒聚集等。

       理化特性：建議開展分子量、核酸濃度/含量、修飾位點及比例（如有）、物理特性（如 pH、滲透壓）等方面的研究。

       生物學活性：根據作用機制，生物學活性研究通常包括對基因修飾效率、目的基因表達的水平、表達產物的功能或體外模擬生理功能的測定等。建議首選定量檢測方法，如可通過目的基因或基因編輯產物的表達量和功能進行分析，關注表達產物是否與預計一致或蛋白表達/基因是否被抑制、空間結構是否符合設計（如多聚體）等。當采用體外轉染檢測細胞的方法時，需關注選擇的檢測細胞是否具有代表性和合理性。

       純度：可以采用瓊脂糖凝膠電泳、高效液相色譜、毛細管電泳等方法開展純度的研究。對于復合核酸類基因修飾系統，建議關注包封率、游離核酸含量等。

       雜質：一方面，雜質可能來自原材料、制備過程、制備 和貯存過程中直接接觸容器和材料的溶解物。如 DNA 模板、酶類試劑、磁珠等原材料和添加的成分；乙醇、異丙醇等有機溶劑；宿主蛋白殘留、宿主 DNA 殘留、宿主 RNA 殘留等。另一方面，與基因修飾系統相關的雜質，可能包括缺失、重排、雜交或突變序列等相關雜質，建議進行定性和定量的相關研究。對于 DNA 類基因修飾系統，相關研究可以包括開環(huán)/線性 DNA 含量、過度甲基化修飾的分子等。對于mRNA 類基因修飾系統，相關研究可以包括降解/斷裂產生的 RNA 片段、加帽不完全的 mRNA、修飾過度的 RNA、RNA 錯配序列、RNA 氧化產物等。結合制備工藝的雜質清除能力，采用適用的方法對雜質的殘留水平進行分析，評估相關安全性風險。

       微生物安全性：可結合工藝過程，檢測可能引入的污染物，包括細菌、真菌、支原體（如適用）、細菌內毒素等。

       其他特性研究：對于使用基因編輯工具酶的修飾系統， 質量研究中建議持續(xù)關注對應細胞產品中修飾系統的殘留 情況，采用生物信息學工具分析靶細胞基因組結構變化、單點和小規(guī)模基因突變以及外源DNA 在基因組中的插入位置、拷貝數等，監(jiān)控基因編輯用酶的細胞內持續(xù)表達時間，考察脫靶效應及相應的安全性影響等。

       4.2 質量標準

       根據風險分析，結合工藝研究與驗證、臨床試驗及商業(yè)化批次質量分析、穩(wěn)定性研究數據等制定合理的質量標準， 明確各檢測項對應的分析方法、標準限度范圍并建立標準品/參考品等。對于一般工藝相關雜質，如經充分驗證證明工藝可對其有效、穩(wěn)定地清除，可結合工藝進行控制，相關殘留檢測可考慮不列于檢定項目中。

       質量控制項目可以包括理化性質、純度和雜質、生物學活性、微生物安全性等。其中，DNA 類的質量標準可以納入外觀、pH 值、含量、鑒別、序列分析、純度、超螺旋比例、生物學活性、無菌檢測、細菌內毒素、雜質殘留等檢測項目。mRNA 類的質量標準可以納入外觀、pH 值、含量、鑒別、序列分析、mRNA 完整性、加帽率、poly（A）長度及分布、生物學活性、無菌檢測、細菌內毒素、雙鏈 RNA 殘留、溶劑殘留等檢測項目。常見的復合核酸類基因修飾系統的質量控制項目包括外觀、pH、顆粒大小及分散系數、滲透壓、鑒別、序列測定、含量/濃度檢測、生物學活性、純度、序列完整性、包封率、復合材料各組分含量（例如脂質鑒別和含量）、游離核酸、可見異物、雜質、微生物安全性等。

       方法學研究與驗證方面，基本原則同病毒載體類基因修飾系統的要求。

       六、穩(wěn)定性研究與直接接觸性容器/材料研究

       （一）穩(wěn)定性研究

       基因修飾系統如涉及到貯存，則需開展相應的穩(wěn)定性研究。采用擬貯存階段樣品的代表性批次開展研究，一般包括貯存、運輸（如適用）和使用穩(wěn)定性研究等。研究開展前， 需統籌制定穩(wěn)定性研究方案，關注各穩(wěn)定性研究所用樣品、直接接觸性容器/材料、檢測時間點、檢測條件和分析檢項等。

       研究中需對能夠反映質量變化的敏感特征進行研究，如 含量、完整性、純度、微生物安全性和生物學活性等。研究 中需涵蓋擬定的各項條件，如溫度、光照、反復凍融（冷凍 貯存時）、振搖等方面。根據實際使用情況，開展使用中穩(wěn) 定性研究，例如復溶或解凍，與復溶稀釋劑的相容性等研究。研究中需采用與實際使用相同材質的直接接觸性容器/材料。

       對于病毒載體類基因修飾系統，穩(wěn)定性研究中建議重點 考察病毒載體的滴度、純度、雜質、微生物安全性指標、生 物學活性等關鍵質量屬性。對于非病毒載體類基因修飾系統， 建議重點關注理化特性、結構完整性、雜質等關鍵質量屬性。例如，DNA 超螺旋結構的比例可能影響 DNA 的轉染率， mRNA 加帽率可能影響 mRNA 的結構穩(wěn)定性和翻譯效率， 建議在穩(wěn)定性研究中重點考察。

       （二）直接接觸性容器/材料研究

       如涉及貯存，需對直接接觸的包裝容器開展相應的包材相容性研究。根據相容性研究結果，結合穩(wěn)定性研究，選擇合理的包裝容器。

       另外，對制備工藝中與樣品接觸的容器和一次性使用材料（如貯存袋、過濾膜、層析介質、管路等），需開展風險評估和/或相應的相容性研究。

       七、參考文獻

       [1] U.S.FDA. Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) information for human gene therapy Investigational New Drug applications (INDs). 2020.

       [2] 國家食品藥品監(jiān)督管理總局. 細胞治療產品研究與評價技術指導原則(試行). 2017.

       [3] EMA. Guideline on development and manufacture of lentiviral vectors. 2005.

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       [5] EMA. Quality, preclinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products. 2018.

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       [9] U.S. FDA. Testing of retroviral vector-based human genetherapy products for replication competent retrovirus during product manufacture and patient follow-up. 2020.

       [10] EMA. Guideline on quality, non-clinical and clinical aspects of medicinal products containing genetically modified cells. 2020.

       《免疫細胞治療產品藥學研究與評價技術指導原則（試行）》

       一、前言

       近年來，生物技術發(fā)展迅速，促進了免疫細胞治療產品的研發(fā)，為一些嚴重及難治性疾病提供了新的治療手段。2017 年，原國家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布了《細胞治療產品研究與評價技術指導原則(試行)》，該指導原則對按照藥品進行研究和申報的細胞治療產品藥學技術要求進行了總體闡述。由于不同免疫細胞治療產品的細胞來源、類型、體外操作等方面差異較大，質量研究和質量控制相較傳統藥物更加復雜，為規(guī)范和指導免疫細胞治療產品按照藥品管理規(guī)范進行研發(fā)和評價，制定本指導原則。

       本指導原則僅基于當前的科學認知，對免疫細胞治療產品的藥學研究提出一般性技術原則和建議，內容不具有強制性。申請人/持有人也可基于產品具體情況采用其他有效的方法開展研究，并說明合理性。隨著技術的發(fā)展、認知的深入和經驗的積累，將逐步修訂和完善相關產品的技術要求。

       二、適用范圍

       本指導原則中免疫細胞治療產品是指源自人體（自體/異體）細胞或人源細胞系的細胞，經過體外操作，包括但不限于分離、純化、培養(yǎng)、擴增、誘導分化、活化、遺傳修飾、細胞庫（系）的建立、凍存復蘇等，再輸入或植入到患者體內，通過誘導、增強或抑制機體的免疫功能而治療疾病的免疫細胞治療產品， 例如嵌合抗原受體 T 細胞（ ChimericAntigen Receptor T-Cell，CAR-T）、樹突狀細胞（Dendritic Cell，DC）等。

       胰島細胞、軟骨細胞等體細胞，以及細胞與非細胞成分的組合產品的細胞部分也可以參考本指導原則。細胞衍生產品，如細胞外泌體、細胞裂解物、滅活細胞等產品，其細胞部分的藥學研究也可能適用。對于經基因修飾的免疫細胞治療產品（如 CAR-T 等），其細胞部分可以參考本指導原則， 基因修飾部分可以參考其他相關技術指南。本指導原則不適用于干細胞、輸血或移植用的造血干細胞、生殖細胞，以及由細胞組成的類組織、類器官產品等。

       本指導原則適用于按照藥品管理相關法規(guī)進行研發(fā)和注冊申報的免疫細胞治療產品，主要適用于上市申請階段的藥學研究。

       三、一般原則

       按照藥品研發(fā)和申報的免疫細胞治療產品應符合《中華人民共和國藥品管理法》、《藥品注冊管理辦法》、《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》）等相關法律法規(guī)的要求。免疫細胞治療產品的生產過程應當符合《藥品生產質量管理規(guī)范》（簡稱 GMP）的基本原則和相關要求。生物安全性方面，應符合國家相關法律法規(guī)要求。人體組織、細胞、基因的來源和處理應符合國家人類遺傳資源管理的相關法律法規(guī)要求。

       （一）研究開發(fā)規(guī)律

       免疫細胞治療產品的藥學研究遵循藥品研發(fā)的一般規(guī)律，貫穿產品的整個生命周期。該類產品個性化較強、工藝復雜多樣、對環(huán)境敏感、非冷凍狀態(tài)下有效期較短，同時細胞本身具備體內生存、自主增殖和/或分化、細胞間相互作用等能力，其藥學研究應充分考慮產品的以上基本特征和特殊性，在符合不同階段技術要求的同時，藥學研究需要不斷優(yōu)化和完善，提高產品的質量。

       1. 申報臨床試驗階段

       申報臨床試驗階段的藥學技術要求需結合產品的自身特點和生產工藝具體情況進行整體的評價與判斷。為了保障受試者的安全，臨床試驗申請通常重點關注與安全性相關的方面，例如生產用原材料的質量控制、降低混淆/污染/交叉污染風險的措施、工藝穩(wěn)定性、與安全性相關的關鍵質量屬性、非臨床研究樣品/非注冊臨床研究樣品（如適用）與臨床試驗樣品的質量可比性等。另外，臨床試驗樣品的生產條件應符合 GMP 的基本原則。

       一般情況下，申報臨床試驗時需要完成以下研究：對生產過程中使用的原材料和輔料，尤其是人源/動物源性材料， 開展充分的安全性分析，評估使用的必要性和合理性。生產工藝需經過實驗室工藝至臨床試驗用工藝的轉化研究評估， 確定與臨床試驗階段相適應的細胞生產工藝的步驟、參數，以及生產過程控制措施等，支持工藝的合理性和穩(wěn)定性，能夠滿足臨床試驗用樣品的產能需求，保證產品的安全性和質量可控性。完成安全性相關的質量研究，例如外源因子、雜質等，并完成相關方法學確認。質量控制方面，設定與臨床試驗階段相適應的質量標準，安全性相關的質量控制可結合質量研究并可參考同類產品的已有安全性標準或共識標準。另外，需要比較分析非臨床研究、非注冊臨床試驗（如適用） 與臨床試驗的生產工藝（廣義的包括原材料、場地、生產工藝、規(guī)模等）和樣品質量的異同，必要時，進行風險評估和深入的研究。申報臨床試驗階段，貯存、運輸和使用的穩(wěn)定性研究條件應具有代表性，穩(wěn)定性研究數據應能支持臨床樣品的實際貯存等條件。直接接觸樣品的材料需經過安全性和適用性的評估。

       2. 申報上市階段

       在充分的工藝開發(fā)和研究基礎上，建立成熟穩(wěn)定的商業(yè)化生產工藝，能持續(xù)穩(wěn)定地生產出安全、有效、質量可控的產品。商業(yè)化生產工藝應經過全面的工藝驗證，嚴格控制生產用材料的質量，明確關鍵生產步驟、關鍵工藝參數范圍、關鍵過程控制項目和可接受標準。經過充分的質量研究、方法學驗證和穩(wěn)定性研究，建立合理的質量標準。根據規(guī)范的穩(wěn)定性研究和包材相容性研究，制定產品有效期，明確運輸、使用過程中的條件和時長，以及確定合適的包裝容器/材料。

       3. 工藝變更

       鼓勵申請人/持有人不斷改進和優(yōu)化生產工藝，持續(xù)提高產品質量。如發(fā)生工藝變更，應根據變更情況開展相應的可比性研究，分析變更前、后產品質量的可比性，以證明變更不對產品的安全性、有效性和質量可控性產生不良影響。

       （二）產品特點相關技術考量

       1. 生產用原材料

       免疫細胞治療產品生產用原材料來源多樣且存在不同程度的風險，應按照《中國藥典》的相關要求進行風險評估和質量控制，建立良好、規(guī)范的生產用原材料的質量管理體系。優(yōu)先選用質量標準級別高的或風險級別低的原材料，對人源/動物源性原材料進行生物安全性評估和控制，降低外源因子的引入或傳播的風險。

       免疫細胞治療產品生產用細胞可為自體來源、同種異體來源、人源細胞系來源等。涉及細胞/組織采集時需建立合理明確的醫(yī)療機構質量評估內容、審核和篩選的原則及標準。建議申請人/持有人對合作醫(yī)療機構進行質量評估、審核和篩選，通過建立和使用采集操作文件等方式確保采集過程的規(guī)范性。另外，結合質量研究情況，需建立供者篩查標準和制定采集細胞/組織的質量要求，并對采集后細胞/組織的保存、運輸和入廠檢驗等過程建立明確的操作規(guī)范。

       2. 生產工藝

       免疫細胞治療產品生產工藝復雜，無病毒清除、終端滅菌步驟，其生產應遵循 GMP 的原則和要求，生產工藝經過驗證并建立清晰的過程控制。應特別關注人員、廠房與設備、原材料控制、環(huán)境與設施等。生產廠房的總體分區(qū)布局應合理，各區(qū)根據工藝步驟及相應的潔凈度級別應合理設計、布局及運維，能符合免疫細胞治療產品生產的質量管理要求， 建議盡量采用自動化的、連續(xù)的、封閉或半封閉的生產設備， 使用專用的、產品特定的、可以滿足控制污染風險的裝置， 最大限度降低微生物、各種微粒的污染風險。建立開場和清場制度，建立全過程控制體系，避免生產用原材料和生產操作過程中可能引入的外源性污染或交叉污染。生產過程中， 應注意不同供者批次細胞的操作時間和空間隔離，避免不同批次樣品的混淆、交叉污染。建立產品可追溯的管理體系， 以確保產品從供者到受者全過程的可追溯性。

       3. 質量控制

       免疫細胞治療產品的質量控制策略包括物料質量控制、生產工藝過程控制、中間樣品質量檢驗、終產品放行檢驗以及留樣檢驗等。原則上，每批產品均需通過質量控制并檢驗合格后放行。但是，考慮到免疫細胞治療產品的特殊性，在最 大 程 度控制風險的前提下，可結合臨床使用緊急程度、產品貯存和運輸的方式/時間等，制定合理、靈活的質量控制策略。

       4. 貯存和運輸

       免疫細胞治療產品的貯存和運輸過程可能涉及到冷凍或冷藏，貯存和運輸的條件、時間，以及相應的包裝等應經過驗證。對于冷凍產品，需關注凍融對產品質量的影響，復蘇后產品質量應能滿足臨床使用要求。對于不需冷凍的新鮮產品，貯存及運輸的條件和時間既要保證產品質量，又需要滿足臨床使用的時效需求。

       四、風險評估與控制

       免疫細胞治療產品具有多樣性、異質性、復雜性等特點， 不同類型產品可能存在不同程度的風險。因此，需要基于產品的特點，從原材料、生產過程、產品質控、穩(wěn)定性、臨床應用過程等多方面因素，進行綜合風險評估?？蓞⒖?ICH Q9 的風險管理理念，科學利用風險評估工具，對具體品種的各類風險因素進行識別、分析和評估，并根據風險評估結果制定相應的風險控制措施。風險評估和控制貫穿于整個產品生命周期，需隨著研究的深入、產品認知的積累，不斷對風險因素進行跟蹤分析和更新，收集數據以進一步確定其風險特征并制定相應控制策略。

       根據目前產品研究情況，免疫細胞治療產品藥學方面的風險因素可能來源于以下幾大類：

       （1） 細胞的來源（如自體/同種異體、人源細胞系等）、獲取方式、類型和生物學特點（如增殖、分化、遷移能力、細胞自身功能、分泌活性物質、啟動/增強/抑制免疫應答的能力等）。

       （2） 物料的安全性風險，如人源/動物源性原材料的使用。

       （3） 細胞的生產過程，如設備開放/密閉性、生產過程 可能的混淆、內外源性污染/交叉污染；對細胞的操作程度， 如體外培養(yǎng)/擴增/活化/誘導/基因修飾/冷凍貯存/復蘇/運輸等；操作對細胞特性的影響程度，如基因修飾對細胞功能的影響 等。

       （4） 質量研究和質量控制，已有的研究和檢驗手段或方法是否能充分表征產品的特性和控制產品的質量，如生物學活性、純度研究（例如非目的細胞群、雜質殘留、非細胞成分）等。檢測方法和檢測指標是否適用，新建檢測方法驗證是否充分，例如，新建檢測方法是否與藥典方法等效，新型快速檢測方法出現假陰性或假陽性結果的風險等。

       （5） 生產用細胞和細胞終產品的貯存、運輸條件和時間，貯存容器的密封性、相容性等。

       （6） 與非細胞材料（生物活性分子或結構材料）形成 組合產品等。

       其他的風險因素類型可能包括：給藥方式（如系統性輸注、局部應用或經手術應用）；受者的不同條件（如是否需要對受者進行預處理，疾病的種類、分期、嚴重程度或進展速度等）對產品的質量、生產周期、貯存方式或運輸時間的要求；既往類似產品的經驗或相關經驗的可借鑒性等。

       五、生產用物料

       生產用物料系指免疫細胞治療產品生產過程中使用的所有原材料、輔料和耗材等，其來源應當清晰，質量應有保證，應特別關注防止外源因子的引入或傳播。物料供應商及合同生產商需經過評估、審核，必要時，通過簽訂質量協議等方式控制質量風險。

       （一）原材料

       原材料直接關系到產品的質量，應按照《中國藥典》“生物制品生產用原材料及輔料的質量控制”的要求進行風險評估和質量控制，建立良好、規(guī)范的原材料質量管理體系。基于免疫細胞治療產品自身的特點及其生產工藝的特點，建議盡量采用符合藥典標準或已經批準用于人體的原材料，否則應盡量使用質量標準級別高、風險級別低的原材料，并確保其安全性和適用性。原材料包括起始原材料（如生產用細胞、生產輔助細胞、體外基因修飾系統）和其他原材料（如培養(yǎng)基、添加因子、其他生化試劑等）。

       1. 起始原材料

       1.1 生產用細胞

       根據目前生物技術的發(fā)展，生產用細胞來源包括人體供者來源（自體細胞、同種異體細胞）和人源細胞系來源。供者細胞的來源應符合國家相關的法律法規(guī)和倫理的要求，并建立“知情與保密”管理體系。細胞系應來源明確、傳代歷史清楚、安全性風險可控。

       1.1.1 供者來源的生產用細胞供者的篩選：

       為了保證產品質量以及生產環(huán)境和生產人員的生物安全性，基于研究、產品風險和供者細胞使用需求，需建立合理的供者篩選程序和標準，并盡量收集供者的相關特征，包括但不限于年齡、性別、既往已知的用藥情況和輻射暴露、疫區(qū)停留情況、既往病史、家族史、病原微生物篩查信息、HLA（human leukocyte antigen）分型信息、血型、血常規(guī)檢測等。供者篩選的標準因產品特點而異，但需要合理設定且能控制相應風險。

       病原微生物篩查方面，同種異體供者應至少符合國家對于獻血的相關規(guī)定，如篩查供者是否存在人類免疫缺陷病毒（ Human immunodeficiency virus， HIV）、乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus， HCV）、梅毒螺旋體等感染。根據產品實際情況，還可增加相應的檢測項目，對于一些特定產品，有明確風險且有明確病毒檢測要求的則需要進行檢測，如 T 細胞治療產品的供者除上述病原微生物外，還建議進行人巨細胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）、人 EB 病毒、人類嗜 T 淋巴細胞病毒（Human T-cell Leukemia Virus ，HTLV）的篩查。自體供者也需要開展相應的病原微生物篩查，以確保生產過程和 產品使用不會造成污染，或不會對患者自身增加額外的風險。根據供者健康/疾病史或疫區(qū)生活停留等的具體情況還可適 時增加相應的篩查項目，并建立驗收的標準和程序。為了確 保檢測方法的靈敏度和檢測結果的可靠性，建議采用經監(jiān)管 機構批準的試劑盒，并優(yōu)先采用血源篩查試劑盒檢測病原微 生物。同種異體供者還需考慮窗口期對病原微生物篩查的影 響。

       除病原微生物檢測外，根據臨床使用和生產需求，可增加對供者的篩查項目，例如對于同種異體來源的產品，建議適時評估包括多態(tài)性的分型，例如血型、供者和受者之間主要組織相容性抗原（Ⅰ類和/或Ⅱ類 HLA）的匹配，在某些情況下可能需關注次要組織相容性抗原，明確并建立分型程序和標準。

       細胞/組織的獲取、處理和檢驗：

       為了保證供者細胞質量滿足生產要求，需對負責細胞/組織采集的醫(yī)療機構進行評估和審核，選擇具有相關資質的醫(yī)療機構作為供者細胞/組織獲取的機構，建立合作醫(yī)療機構名單，制定相應的細胞采集操作規(guī)范，并鼓勵簽訂相關質量協議，同時定期對醫(yī)療機構采集供者細胞/組織和臨床應用細胞終產品的質量情況進行回顧分析和評估。

       細胞/組織的獲取操作過程需經過充分研究。根據產品特 點并基于研究，確定細胞或組織來源、采集方法和其他相關 識別信息，包括但不限于采集場所/環(huán)境要求、使用的設備和 程序、采用的試劑耗材、采血量等。細胞/組織獲取包括單采 血采集、外周血采集、淋巴組織分離、臍帶血采集、腫瘤組 織分離等多種采集方式，建議綜合考慮細胞類型、供者健康 狀況和細胞需求量等，優(yōu)先選用易于標準化操作的采集方式， 如血液成分單采技術等。對獲得細胞/組織的方法需進行研究 和論證，包括但不限于有關酶的類型、抗凝劑、血分儀器和 程序（循環(huán)血量、流速等）、手術方式等。采集中盡量減少 相關雜質，如細胞碎片、非目的細胞含量等，并考慮降低對 供者組織、器官施加的破壞程度。避免不必要的或不適當的 加工和處理步驟，以避免損壞細胞的完整性和/或功能，進而 降低發(fā)生不良反應或者治療失敗的風險。采集細胞/組織的醫(yī) 務人員必須經過嚴格培訓，獲得相應的資質和授權方可上崗 操作，培訓應當有記錄。實施采集操作的環(huán)境應能保證采集 細胞/組織的微生物安全性。采集過程中應對微生物污染、樣 品交叉污染或混淆風險進行控制。

       采集的細胞/組織如果需要進一步處理，如混合、分批、包裝、保存、運輸等，需開展相應的研究、驗證工作，并根據研究情況確定適宜的保存條件、運輸方式和時間，制定相應操作規(guī)范。采集的細胞/組織在入廠時，需進行外觀、包裝完整性等方面的檢查，以及運輸溫度、時間和供者信息等方面的確認。生產前，根據工藝要求、產品特點等，可進行細胞類型、數量、表型、活率以及微生物等方面的檢測，如細胞類型可通過相關的基因型和/或表型標志物進行鑒定和確認，標志物陽性的細胞比例可以作為預期細胞群指標評估的依據。鼓勵研究與成品質量相關的細胞/組織質量指標，并納入采集細胞/ 組織質量放行標準中。

       1.1.2 細胞系來源的生產用細胞

       人源細胞系來源的免疫細胞治療產品，其使用的細胞系應滿足來源清楚，傳代歷史明確，檢定結果全面且合格等要求。原則上，應對細胞系建立細胞庫并進行分級管理，以用于生產。細胞庫的層級可根據細胞自身特性、生產情況和臨床應用情況綜合考慮；并參照《中國藥典》、ICH Q5A、ICH Q5D 等相關要求建立細胞庫的檢驗標準，檢驗結果應符合要求。細胞系可能經過基因修飾后用于生產，如有可能，建議對基因修飾后的細胞系進行建庫和檢驗。

       1.1.3 生產用細胞的貯存

       建議建立或采用穩(wěn)定可控的細胞存儲體系或平臺，研究確定供者細胞或細胞系合適的保存條件和包裝材料，在不改變細胞特性的情況下，對細胞進行妥善的保存，確保貯存過程中不增加微生物污染風險，并且細胞的活率、密度、純度和生物學功能等可滿足生產要求。

       1.2 生產輔助細胞

       根據用途或功能，生產輔助細胞可能為病毒包裝細胞、滋養(yǎng)細胞（Feeder cells）等。生產輔助細胞，應符合來源和培養(yǎng)傳代歷史清楚、安全性風險可控、進行細胞庫分級管理（如適用）、檢驗結果合格的基本原則。生產輔助細胞如需要擴大培養(yǎng)，建議盡可能一次性完成最終生產輔助細胞的擴大培養(yǎng)，或確保每次擴大培養(yǎng)工藝和質量的一致性，并評估擴大培養(yǎng)過程中是否引入了新的風險。如適用，建議建立不同生產步驟/階段的檢測程序，如檢測時間、檢驗項目、檢測方法和驗收標準等。需要關注其種屬特異性病毒檢測和可能引入的安全性風險。涉及滋養(yǎng)細胞失活處理的工藝，如輻照或添加藥物等，應經過研究與驗證。

       1.3 基因修飾系統

       如涉及基因修飾，基因修飾系統部分請參考相關技術指南，不在本文贅述。

       2. 其他原材料

       細胞的采集、分選、培養(yǎng)以及對細胞進行基因修飾過程中還需要使用多種材料，如培養(yǎng)基、酶、抗體、細胞因子、血清、抗生素、磁珠、其他化學品或固體支持物（例如凝膠基質）等，這些材料的使用可能會影響免疫細胞治療產品的質量。其風險評估內容包括原材料的來源、組分、功能、使用階段、質量控制等，需要具備的相關文件包括來源證明、檢驗報告書（COA）、說明書、無 TSE/BSE 聲明等，以證明其符合使用要求，適用于其預期用途。基于風險情況，其生產過程可參照 GMP 的相關原則或要求。

       生產過程中如需使用抗原，需滿足來源清楚、風險和質量可控的要求。重組表達或合成的抗原需明確選擇依據、抗原的序列、生產工藝相關的風險因素和質量控制，明確抗原的雜質控制（包括外源病毒因子等）情況。腫瘤細胞裂解物抗原需關注生產工藝的穩(wěn)定性和質量相關風險，如成瘤性或外源因子污染等。需充分評估免疫細胞治療產品中抗原殘留可能引起的免疫相關風險等。

       生產過程中盡量避免使用具有潛在致敏性的材料，如 β- 內酰胺類抗生素（如青霉素）等。盡量避免使用動物源原材 料，如動物血清、動物來源的蛋白質，盡可能使用成分明確 的非動物源性材料替代。如果必須使用動物源原材料，需要 開展相應的研究證明其使用的必要性和合理性，根據原材料 的物種來源、生產地區(qū)、生產工藝等特點建立完整的質控體 系，評估 TSE/BSE 安全性風險，并對動物源原材料殘留量進行檢測及開展安全性風險評估。嚴禁使用疫區(qū)來源的動物血 清/血漿，不得使用未經過安全性驗證的血清/血漿。如生產過 程使用自體血清或自體血漿，需要開展血清/血漿的生產工藝、質量、穩(wěn)定性、包裝、貯存等研究。生產過程中盡量避免非藥用異體人血源性材料的使用，如確需使用，需要基于風險， 可以參考血液制品的相關要求，開展外源因子污染、有效性和批間一致性等方面的研究，并結合生產商放行檢測標準制定合理的內控標準。

       （二）輔料

       輔料請見“生產工藝”章節(jié)中“制劑處方和工藝”部分。

       （三）耗材

       生產過程中使用的培養(yǎng)瓶、管路、濾器等一次性耗材、培養(yǎng)與包裝容器，及與中間樣品接觸的生產設備和材料等需經過嚴格的篩選，開展適用性和生物安全性評估，并根據評估結果開展相應的相容性研究。

       免疫細胞治療產品可能與其他醫(yī)療器械、基質、微囊等材料形成組合產品。細胞部分可以參考本指導原則。整體組合產品需考察和評估細胞與器械等材料的互相作用及風險。

       六、生產工藝

       免疫細胞治療產品生產廠內的生產工藝通常包括從供者細胞/組織接收或細胞系起始培養(yǎng)到最終細胞收獲、制劑、貯存和運送出廠的全過程。整體生產工藝需進行充分的研究和驗證，以確定穩(wěn)定可行的商業(yè)化生產工藝，包括但不限于細胞接收、采集細胞的凍存（如適用）、體外操作、制劑、產品冷凍等。確定的生產工藝包括合理的工藝操作步驟和參數、生產過程控制和可接受標準等。生產的全過程需進行監(jiān)控，包括工藝參數和過程控制指標的監(jiān)測等。組合產品生產工藝的研究和驗證還需包括單獨成分組合形成最終組合產品的所有工藝步驟，以保證生產工藝的可行性和穩(wěn)定性。

       （一）工藝研究

       隨著研究的深入，生產工藝需不斷優(yōu)化。工藝研究中建 議盡量采用與生產實際來源、質量一致的細胞/組織開展研究。如果細胞量有限（如自體細胞產品），可考慮采用具有相似 特征、具有代表性且有足夠數量的細胞進行研究。

       1. 生產產能和批次定義

       免疫細胞治療產品生產產能的大小直接影響到可接受治療的患者人數、治療的次數及產品的質量，由細胞特性、生產工藝、廠房、人員、設施設備、臨床用途等多種因素決定。生產產能的制定需要經過研究驗證。在從實驗室制備向工業(yè)生產轉化的階段，需關注生產產能擴大的方式，開展研究保證產品質量。如果在生產產能擴大研究中，始終保持生產工藝不變和每批產品批生產量不變，而是通過增加生產批次的方式擴大生產產能時，需重點關注原輔料、人員、公共設施、設備、生產環(huán)境和質量監(jiān)控及檢驗等方面的驗證，以確保產能擴大不會對產品質量產生影響。如果在生產產能擴大研究中，引入了新的生產工藝，如采用了多層細胞工廠或者細胞反應器等設備，需重點關注變更工藝對質量的可能影響，開展相應的可比性研究或評估。

       定義批次的目的是保證免疫細胞治療產品的質量均一性和可追溯性。同一批次的產品，應來源一致、質量均一， 按規(guī)定要求抽樣檢驗后，能對整批產品做出質量評定。由于免疫細胞治療產品工藝多樣、復雜，可結合產品工藝特點制定適用的批次定義。根據現有產品工藝情況，免疫細胞治療產品批次可考慮定義為：在同一生產周期中，采用相同生產工藝、在同一生產條件下生產的一定數量的質量均一的產品為一批。單一批次所生產出來的所有細胞的總量為此次生產的批量。

       2. 生產工藝開發(fā)

       免疫細胞治療產品工藝開發(fā)需根據目標產品質量概況， 結合理化特性和生物學特征，合理設計試驗，不斷優(yōu)化，逐步建立穩(wěn)定的生產工藝和關鍵工藝參數。對于目標產品質量概況研究，需從多個方面對產品的特征如表面標志物、細胞活率、純度、生物學活性、目的基因轉導效率等進行分析， 并從中初步獲得可能影響產品安全性和有效性的關鍵質量屬性。根據工藝參數對關鍵質量屬性的影響來確定關鍵工藝參數，并建立相匹配的參數范圍，隨著工藝研究的深入和經驗的積累而不斷優(yōu)化?？赡艿年P鍵工藝參數包括但不限于：起始細胞數量，培養(yǎng)基組成，細胞擴增、誘導、基因修飾操作相關工藝參數等。

       在細胞體外培養(yǎng)工藝開發(fā)中，需考慮細胞體外生長的條 件和任何操作可能對細胞的影響，以保持細胞的完整性和功 能特性。對操作的步驟（換液、傳代、激活、基因修飾、誘 導等）、添加的成分（培養(yǎng)基、重組蛋白及相關生長因子、血清替代物、磁珠、病毒載體、核酸物質、促轉導/轉染試劑 等）、培養(yǎng)容器、培養(yǎng)條件（如溫度、溶氧、pH 等）、雜質去除、培養(yǎng)時間或最大傳代次數、培養(yǎng)規(guī)模和參數設置等都 應當進行相應的研究和驗證。為了監(jiān)測細胞質量情況，建議 建立檢測方法和標準，持續(xù)監(jiān)測生產過程中細胞的特性情況， 如細胞培養(yǎng)擴增后細胞的基因型和/或表型以及功能的變化 等以確定或優(yōu)化生產工藝。

       如果細胞的培養(yǎng)介質不是液態(tài)培養(yǎng)基，而是非液態(tài)基質/器械/支架內（上）等培養(yǎng)介質，需考慮其對細胞生長、功能和完整性的影響，例如可降解生物材料可能引起的細胞環(huán)境變化（如 pH 值、離子濃度、氣-液界面等改變），同時還應考慮細胞可能對培養(yǎng)介質產生的影響（如降解速率、介質形態(tài)、介質組成成分等）。

       若存在細胞體外誘導的操作，需對誘導的方法和條件進行研究，結合細胞生長特性的變化、細胞的表型和/或基因型的變化、細胞功能的變化、誘導物質的殘留、目的細胞群和非目的細胞群的比例變化進行研究和驗證，并不斷優(yōu)化。

       若存在細胞體外基因修飾的操作，需對操作的方法（如電轉、病毒載體轉導等）和條件，例如促轉導/轉染試劑的選擇、轉導設備（如電轉儀）、病毒感染復數（MOI）等條件進行研究，并可結合目的基因的轉導/轉染效率、目的基因在染色體中的整合情況、目的基因表達穩(wěn)定性、細胞基因型和

       /或表型、功能的變化、致癌性等風險基因的殘留和去除、病毒復制能力回復突變、插入突變或插入位點等進行工藝的研究、優(yōu)化和驗證。

       3. 制劑處方和工藝

       制劑研究的總體目標是確保劑型和處方合理，工藝穩(wěn)定， 有效控制生產過程，適合工業(yè)化生產。研究中根據產品自身 的特性和臨床應用情況確定產品的劑型、制劑處方和處方工 藝。制劑研究一般包括：

       （1） 劑型的選擇

       免疫細胞治療產品一般為注射劑。如果使用其他劑型， 應當結合臨床使用情況合理選擇。

       （2） 處方研究

       根據免疫細胞治療產品的特性、穩(wěn)定性研究結果等，結合劑型特點、用法和給藥途徑，合理設計試驗，進行處方篩選和優(yōu)化，最終確定處方。處方研究主要關注規(guī)格、輔料成分和用量、用法，以及產品在貯存、運輸、使用等過程中的穩(wěn)定性表現等。制劑處方應與貯存條件相適應，免疫細胞治療產品常涉及冷藏和/或冷凍。研究中，應驗證細胞冷藏和/或冷凍條件和時間等對細胞特性和活力狀態(tài)的影響，以確定制劑處方。非冷凍免疫細胞治療產品的貯存時間通常較短，其制劑處方應能滿足在貯存、運輸和使用期間產品質量穩(wěn)定的要求。

       輔料的使用、用量和質量情況應加以研究和驗證，證明其使用的必要性、安全性和合理性。宜優(yōu)選藥用或經批準可用于人體的輔料，否則需要開展全面的研究與評估。對于新型的輔料，除以上研究外，建議開展適當的非臨床安全性研究，具體可以參考已經發(fā)布的相關技術指導原則。冷凍的免疫細胞治療產品常用冷凍保護劑，其主要分為穿透性冷凍保護劑（如二甲基亞砜（DMSO）、甘油、乙二醇等）和非穿透性冷凍保護劑（如聚乙烯吡咯烷酮、白蛋白、蔗糖、海藻糖等）。在選擇細胞冷凍保護劑時，可能考慮的因素：細胞冷凍保護劑本身的**及免疫原性（如 DMSO、白蛋白等），對細胞特性、功能及穩(wěn)定性的影響，去除方法或殘留量的可接受標準，冷凍的設備和程序方法，細胞冷凍保護劑的質量、來源、成分、用量、用法等。研究中應當驗證細胞冷凍保護劑（如 DMSO 等）的成分、用量及其合理性。結合選用的冷凍保護劑，如果產品在給受者使用前需要經過物理狀態(tài)改變、過濾、清洗、容器轉換、調整劑量、與其他材料聯用等操作， 應進行充分的研究和驗證。

       （3） 制劑工藝研究

       根據免疫細胞治療產品的特性、穩(wěn)定性研究結果等情況， 結合生產條件和設備，進行工藝研究和驗證，確定制劑生產 工藝并建立適當的過程控制標準。制劑工藝研究可以單獨進 行，也可以結合處方研究同時進行。制劑工藝研究需要考慮 混淆和污染的風險防控，制劑工藝過程中接觸材料（容器） 對細胞的吸附或作用，灌裝產生的剪切力對細胞的影響等， 同時確保細胞數量和密度等滿足要求。

       （二）過程控制

       良好的過程控制是保證產品質量的關鍵。合理設立生產過程控制的取樣時間點、檢測項目和標準或相關工藝參數的輸出標準，以確保產品生產工藝的穩(wěn)定性和不同批次間產品質量的一致性。對于封閉式細胞培養(yǎng)體系，可依據封閉系統結構、取樣流程等特點酌情安排過程控制的取樣操作，防止污染。

       根據產品和生產工藝特點建立合理的過程控制策略，建議關注以下幾個方面：（1）監(jiān)控樣品混淆和交叉污染，包括生產過程中的供者材料、中間樣品和產品，尤其注意不同供者或細胞系來源的細胞操作應進行時間/空間有效隔離；每次生產結束后需進行清場，采用經驗證的標準程序進行清潔及消毒處理。每次生產操作前，對清場情況進行確認。（2）監(jiān)控微生物及其代謝產物/衍生物（如內毒素）污染，如適用，建議在關鍵時間點對適合的中間樣品開展無菌、支原體等安全性相關檢測或采取相關的措施加以控制。（3）監(jiān)控生產過程中的關鍵工藝參數或關鍵質量屬性，如細胞活率、增殖能力、細胞表型、雜質含量、生物學活性等。過程中的質量監(jiān)控與放行檢測可相互結合與補充。（4）確保生產全過程樣品和生產物料（包括從細胞/組織采集過程、生產、運輸到臨床應用整個過程）的可追溯性。

       （三）工藝驗證

       免疫細胞治療產品工藝驗證可遵循生物制品工藝驗證的一般原則，對已經確定生產工藝的各個操作單元、中間樣品存儲條件和時間、培養(yǎng)基/緩沖液制備和存儲條件、運輸過程等進行工藝驗證。工藝驗證應當能證明生產工藝按照規(guī)定的工藝參數能夠持續(xù)生產出符合預定用途和注冊要求的產品。

       在符合倫理和知情同意的情況下，工藝驗證中建議采用與臨床應用情境類似的細胞（如患者來源細胞）開展相應的研究；在工藝研究充分的情況下，自體細胞治療產品或其他細胞來源受限的產品，也可以考慮采用經研究和評估認為具有代表性的健康供者細胞進行相關工藝驗證，并同時考慮在上市后開展同步驗證。

       驗證工作中需關注同時同階段生產最大產能的研究與驗證，實際生產的最大產能不得超過經驗證的最大產能，產能的增加需要經過適當的驗證。研究中需考慮原輔料、人員、設施設備、環(huán)境、質量檢測能力、整體運行能力等方面對最大產能的支持能力，考慮對最差條件的驗證。完成商業(yè)化生產工藝驗證后，還需進行持續(xù)工藝研究與驗證，保證工藝處于受控狀態(tài)。

       七、質量研究與質量控制

       （一）質量研究

       質量研究是工藝優(yōu)化與改進、制定整體控制策略及保證產品質量的基礎，貫穿于產品的全生命周期，全面的質量研究有利于關鍵質量屬性的確定，需隨著對產品認識的深入和技術的發(fā)展不斷補充和完善。質量研究需采用相應研究階段（如非臨床研究批次、臨床試驗批次、商業(yè)化生產批次）或適當步驟（如供者細胞或細胞系細胞、生產過程中間樣品或成品）的代表性樣品。

       免疫細胞治療產品的質量研究一般包括安全性研究、純度和雜質研究、功能性研究、其他項目的研究等，也可根據產品的自身特點增加其他相關的研究。

       1. 安全性研究

       主要包括微生物安全性研究和產品本身相關的安全性研究。前者是指對微生物污染和微生物代謝產物/衍生物污染的研究，如真菌、細菌、支原體、病毒、內毒素等；后者是指除微生物學安全性外，對產品本身可能導致安全性問題的相關研究，如細胞惡性轉化、非目的細胞殘留等。根據細胞種類、特性和來源、生產工藝和相關物料特點進行上述兩方面的安全性研究。建議至少包括以下幾個方面（如適用）：

       外源因子：生產用細胞、生產輔助細胞、其他人源/動物源性原材料，以及生產過程中都可能引入外源因子。在進行常規(guī)外源因子檢測的基礎上，根據可能引入的外源因子，可結合體內和體外方法開展特定外源因子的檢測。例如，生產中若使用牛血清，需進行牛源特定病毒的檢測；若使用豬胰酶，需進行豬源特定病毒的檢測；若使用滋養(yǎng)細胞，需進行細胞種屬特異性病毒的檢測。對于同種異體治療產品，在開展人源病毒檢測時，應關注供者處于感染窗口期的可能，適時開展二次取樣和檢測。

       復制型病毒（Replication competent virus，RCV）：RCV 通過病毒載體回復突變產生，是與產品安全性相關的重要檢測項目，需要通過適用的檢測方法進行研究。

       細胞惡性轉化：某些情況下，產品中的細胞有發(fā)生惡性轉化（包括但不限于成瘤性、促/致瘤性等）的可能性。在此種情況下，可根據免疫細胞的來源、產品中目的細胞的特點或殘留雜質情況等因素，結合體內和體外實驗對細胞發(fā)生惡性轉化的可能性進行研究和評估。

       基因插入位點和拷貝數：由于其關系到產品的安全性和有效性，需采用適用的檢測方法進行研究，探索其與安全性和療效的相關性。

       異常免疫反應：建議對異體來源的細胞產品選擇適用的方法進行免疫學反應檢測。

       非目的細胞和雜質研究：具體見下文。

       2. 純度和雜質研究

       免疫細胞治療產品的質量和生物學活性往往和產品中目的細胞的純度相關。實際情況可能比較復雜：一方面，不同類型產品對目的細胞純度要求各不相同；另一方面，同一類型產品中不同的細胞群或亞群對產品生物學活性的影響也各不相同，需要研究不同細胞群或亞群的細胞比例。細胞純度研究可能包括但不限于：

       活細胞比例：需要采用適用的方法對活細胞比例進行研究。當免疫細胞治療產品為單一細胞種類并具有均一性時， 可以通過直接檢測產品中活細胞的比例來研究產品的純度。

       細胞群或亞群比例：當免疫細胞治療產品為多種不同類型或不同基因型/表型細胞所組成的混合物時，建議研究樣品中細胞的組成成分，如細胞群或亞群的組成和比例。如，根據成熟階段（幼稚、衰老、耗竭等），對免疫細胞群或亞群進行研究。

       目的細胞的比例：可通過檢測目的細胞比例來研究產品的純度。比如在 CAR-T 產品中，在進行了 CAR 轉入的操作后，純度分析的目的細胞群應選擇能同時正確表達 CAR 和T 細胞表面標志物的目的細胞，不能包括未表達 CAR 的 T 細胞和雖表達 CAR 但 T 細胞表面標志物不正確的細胞。

       非目的細胞的比例：非目的細胞對產品質量可能具有不利的影響，因此，細胞純度研究還應包括非目的細胞的定性和/或定量研究。例如腫瘤細胞、iPS 細胞等非目的細胞的殘留具有較高安全性風險，因此需要進行其比例的研究并進行嚴格的控制。經研究，當非目的細胞對產品安全性和有效性不產生影響時，需研究其組成和比例，必要時，控制批間一致性。

       雜質：

       工藝相關雜質：是指工藝中引入的雜質，如殘留的蛋白酶、誘導試劑、促轉導/轉染試劑、血清、病毒載體、以及殘留的磁珠、纖維和塑料微體、滋養(yǎng)細胞等，需采用適用的方法進行研究。

       產品相關雜質：如非目的細胞、細胞非預期表達的產物、死細胞殘留、細胞碎片和其他可能的降解產物等，需采用適用的方法進行研究。

       對于產品中可能存在的高風險雜質成分，應當建立和明確去除方法及殘留定量檢測方法，如果雜質成分不能有效去除，則應當在動物模型或其他系統中進行安全性和**評估， 并根據人體暴露最大劑量或體內安全性研究結果設定殘留 限度。

       3. 功能性研究

       功能性研究是通過體內/外功能分析實驗來評價免疫細胞治療產品是否具備預期的生物學功能的研究。根據細胞產品的性質、特點和預期用途（適應癥），尤其是實現臨床治療效果的具體機制和指標，建立和驗證合適的體內/外功能性分析方法，開展功能性研究。其功能性研究可能包括但不限于以下方面：

       分化/發(fā)育潛能：可涵蓋產品中細胞可能的分化/發(fā)育方向。其中，與臨床應用安全性和有效性相關的分化/發(fā)育功能建議作為代表性評價內容納入質量控制。

       表達產物的定性與定量研究：當免疫細胞治療產品功能涉及內源或外源基因產物的表達時，應開展對表達產物的研究，例如表達產物的種類、特性、表達水平、修飾程度（如糖基化、磷酸化等）、聚合性（如同源或異源聚合物等）等。對外源性刺激的應答：可研究相關因素作用于細胞后產生的細胞學反應，如細胞形態(tài)的改變、細胞增殖能力的改變、細胞因子的分泌、表型的變化、信號通路的改變、代謝的改變等。

       生物學活性：根據產品特點和作用機制，開展與產品體內預期功能相應的生物學活性研究，如靶細胞的效應（如溶解反應、誘導細胞凋亡或增殖）、分泌特定因子等。如果生產過程中通過添加成分刺激（如誘導、抗原負荷等），或者進行基因修飾（如基因編輯、外源基因表達等）后獲得功能性細胞，需對刺激或操作前、后的細胞開展適用的生物學活性研究，對比分析刺激或操作前、后細胞的功能情況。當直接的研究試驗受到所需細胞數量或其他條件限制時，可研發(fā)和實施合理的替代性檢測方法。

       4. 其他項目的研究

       理化特性方面，可根據產品特性和劑型，對外觀、pH、滲透壓、明顯可見異物等進行研究。

       細胞活率和增殖能力方面，可采用適用的檢測方法，如活細胞計數、細胞倍增時間分析、細胞周期分析、克隆形成率分析等進行研究。

       某些免疫細胞治療產品的生產和/或使用可能需要將多種不同類型的細胞產品進行混合，可對產品的混合特性進行質量研究，并確定混合產品的關鍵質量屬性。在混合前，應對各獨立的免疫細胞治療產品分別開展相關質量研究，分別確定各自的關鍵質量屬性。

       （二）質量控制

       1. 質量標準

       質量標準需基于全面的風險分析、積累的生產和臨床研究經驗以及統計分析（如適用）、可靠的科學知識，并結合質量研究、穩(wěn)定性研究等結果而制定。質量標準包括檢驗項目、檢測方法與標準限度。可依據檢測需求合理設置樣品檢測階段，如中間樣品、放行檢測、留樣樣本等，以有效控制產品質量。檢驗項目一般包括鑒別、生物學活性、純度、雜質、轉基因拷貝數（如適用）、細胞數量（活細胞數、功能細胞數/比例等）和一般檢測（如 pH、滲透壓、無菌、支原體、細菌內毒素、外觀、明顯可見異物等）等。

       （1） 檢驗項目和檢測方法

       細胞鑒別：建議采用適用的、特異性強的檢測方法，必要時，采用多種方法進行鑒別。采用的方法可能為細胞形態(tài)、HLA 分析、遺傳多態(tài)性分析、核型分析、STR 分析、代謝酶亞型譜分析、細胞表面標志物及特定基因表達產物分析等。

       純度：結合質量研究，根據產品特征選用純度檢測的指標，如細胞表面標志物、特定生物學活性等。

       無菌和支原體：依據《中國藥典》無菌檢查法和支原體檢查法，對細菌、真菌及支原體進行檢測。當檢驗樣品量有限，或需要快速放行等特殊情況下，如藥典方法無法滿足， 可考慮開發(fā)新型的無菌和支原體的檢測方法進行放行檢測， 但是新型檢測方法應經過充分驗證。在積累數據階段，可以并行采用經充分驗證的新型方法和藥典方法。

       細菌內毒素：依據《中國藥典》中的細菌內毒素檢查法對細菌內毒素進行檢測，或采用其他經過驗證的適用方法。

       細胞內源和外源病毒因子：根據質量研究的結果確定免疫細胞治療產品及其生產過程中可能引入的內、外源病毒因子，在此基礎上選擇合適的方法如細胞培養(yǎng)法、核酸或蛋白檢測法、熒光抗體檢測法等進行內、外源病毒因子檢測。

       復制型病毒（RCV）：對于使用病毒載體進行基因修飾的免疫細胞產品，RCV 作為重要的安全性風險關注點，除了病毒載體階段的檢測控制外，細胞終產品還需建立完善的檢測和風險控制策略。當細胞放行檢測采用快速 RCV 檢測方法時，建議進行留樣。在臨床試驗階段或上市早期階段用指示細胞培養(yǎng)法采用留樣進行并行檢測分析，積累數據；在上市后成熟階段，留樣可以作為必要時的研究分析。

       生物學活性：建議選擇可表征產品生物學活性且適宜用于放行檢測的方法。某些情況下，如產品具有多種作用機制， 或單一檢測方法不能充分反映其作用機制的情況下，可考慮采用一種以上的方法進行生物學活性檢測。

       雜質控制：根據生產工藝和質量研究的結果，明確產品生產過程中殘留的、可能影響產品質量的工藝相關雜質和產品相關雜質，選擇適用的方法進行檢測和控制。對于一般工藝相關雜質，如經充分驗證證明工藝可對其有效、穩(wěn)定地清除，可結合工藝進行控制。

       成瘤性/致瘤性：如適用，可根據質量研究結果，考慮是否納入成瘤性/致瘤性控制項目。

       除以上例舉的檢測項目和方法外，可以結合實際研究情況進行合理的調整。

       （2） 標準限度

       質量標準限度制定可依據產品研發(fā)相關數據、非臨床研究批次檢測數據、臨床試驗批次檢測數據、工藝驗證數據以及穩(wěn)定性研究數據等，同時可兼顧產品的特點和目前的科學認知與共識。建議重點依據臨床試驗批次的檢測數據制定標準限度。

       2. 檢測方法的驗證

       檢測方法應經過研究與驗證，特別是自建的產品特異性的方法。藥典中收錄的方法應進行適用性確認。藥典方法經過修訂或替代時，需驗證其合理性。

       方法學驗證研究需關注陽性對照、陰性對照、抑制性對照（如適用）、供試品取樣代表性和取樣量、檢測指標、判定標準等方面的合理性。

       對于有效期短或樣本量小的產品，可考慮采用快速、微量的新型檢測方法。新型檢測方法應進行充分的驗證，并與藥典檢測方法進行比較和評估（如適用）。

       研發(fā)過程中如出現檢測方法的變更，應對變更方法進行評估和研究，證明擬變更方法優(yōu)于或等效于變更前方法。

       3. 標準品/對照品

       在條件許可的情況下，可依據需要建立標準品/對照品， 以滿足檢測的需求，并有助于確定設備和試劑在規(guī)定的范圍內工作，提高檢測結果的可靠性和準確性。

       建立的標準品/對照品需有明確的預期用途，采用經驗證的檢測方法進行檢驗和標定，開發(fā)各個階段使用的標準品/對照品應可以溯源，并且還需開展相應的穩(wěn)定性研究。

       4. 其他情況

       產品放行檢測是確保產品質量滿足臨床應用的重要保障，但是部分免疫細胞治療產品因時效較短，可能無法在臨床使用前完成全部放行檢測。在這種情況下，如果風險被充分研究評估，并經過驗證證明可控的情況下，可以考慮在完整放行檢測結果獲得前先行使用（使用放行）；當風險未被充分研究評估或評估認為可能造成嚴重的無法挽回的后果時，則不建議考慮使用放行。

       為加強質量控制，降低風險，建議考慮以下一些措施：

       （1） 在放行檢測時間受限時，可考慮加強原材料的質量控制和過程控制，將其與放行檢測相結合，控制風險。

       （2） 檢測方法方面，可采用快速替代檢測方法進行檢測，以最 大 程 度控制風險。在充分完成替代檢測方法驗證前，需開展藥典方法和替代檢測方法的平行檢測，積累數據并在研 究中不斷優(yōu)化。

       （3） 在使用放行的同時，應繼續(xù)完成完整的放行檢測。需充分考慮相關風險，提前制定措施，當后置的放行檢測結果出現異?；虿缓细駮r，需啟動相關風險適用的緊急預案。

       5. 使用前的質量核準

       產品在給藥前需進行質量核準，特別是存在使用前細胞復蘇、稀釋等操作的情況。核準的內容可包括但不限于：標簽核對；貯存和運輸條件復核；操作步驟復核；外觀、明顯可見異物的觀察；細胞形態(tài)觀察（如適用）；活細胞數及比例測定（如適用）；快速無菌檢測（如適用）等。

       八、穩(wěn)定性研究

       免疫細胞治療產品的穩(wěn)定性研究是通過設計試驗，獲得其質量屬性在各種環(huán)境因素（如溫度、凍融等）的影響下隨時間變化的規(guī)律，是產品質量標準和產品有效期（或中間樣品暫存期）制定的重要依據。同時，也可用于判定工藝參數、制劑處方、包裝材料等是否合理。

       （一）基本原則和貯存穩(wěn)定性研究

       免疫細胞治療產品可參照一般生物制品穩(wěn)定性研究的要求，并根據產品自身的特點、臨床用藥的需求，以及包裝、貯存和運輸的情況設計合理的研究方案。

       研究用樣品：依據特定生產工藝的需要和相應細胞的可獲得性，選擇代表性樣本開展研究，包括采集的起始細胞、生產過程中間樣品、細胞成品、臨床使用過程中樣品等，研用樣品的生產、使用和質量（如總細胞密度和體積范圍等） 應可代表實際情況。樣品的包裝容器與密封系統應選擇與實際貯存相同或同材質的小規(guī)格包裝容器與密封系統。對于自體免疫細胞治療產品，如患者細胞使用受限時，可采用經評估具有代表性的健康供者細胞開展研究。

       考察條件：根據產品在貯存、運輸和使用過程中的實際情況和可能的暴露條件選擇合理、全面的穩(wěn)定性考察條件。例如，對于需冷凍貯存的細胞成品、起始細胞或中間樣品， 需研究其在冷凍和復蘇條件下細胞質量（如細胞數量、活率、外觀完整性、功能等）的變化情況；需要時，還可研究多次凍融的影響。此外，可根據產品在貯存、運輸、使用中可能暴露的劇烈條件，開展如高溫、輻照、振蕩等影響因素研究。

       檢測指標和檢測方法：通常結合產品特性，設定合理、全面的檢測指標，包括但不限于理化特性、細胞活率、目的細胞比例、生物學活性、微生物安全性指標等。研究需合理設置各項指標的考察頻次，如至少在擬定有效期的初期和末期進行無菌試驗或替代試驗（如容器/密封系統的完整性試驗）。若穩(wěn)定性數據提示輔料在有效期內可能發(fā)生氧化、降解等對產品質量產生不良影響時，有必要在穩(wěn)定性試驗中對輔料含量或相關活性加以監(jiān)測。所用的檢測方法應經過驗證研究，可靈敏地反映產品穩(wěn)定性變化趨勢。

       （二）運輸穩(wěn)定性研究

       免疫細胞治療產品通常要求冷鏈運輸，對產品的運輸過程應進行相應的穩(wěn)定性模擬驗證研究。穩(wěn)定性研究需充分考慮運輸路線、交通工具、距離、季節(jié)、時間、條件（如溫度、輻射、振動情況等）、產品包裝情況（如外包裝、內包裝等）、產品放置情況和監(jiān)控器情況（如溫度監(jiān)控器的數量、位置等） 等各方面因素，建議模擬實際運輸的最差條件開展研究。對于懸浮在液體中保存的細胞成品、起始細胞或中間樣品，需要在研究中關注產品的放置方向（如正立、倒立或水平放置等）和振蕩對細胞的影響。通過運輸穩(wěn)定性研究，確認產品在運輸過程擬定的貯存條件下可以保持產品的穩(wěn)定性。并建議評估產品在短暫的脫離擬定貯存條件（如產品脫離冷鏈的溫度、次數、總時間等）對產品質量的影響。

       （三）使用穩(wěn)定性研究

       使用穩(wěn)定性研究設計時應考慮臨床實際使用的場景對產品質量的影響，如注射器及針頭種類、抽吸與推注及滴注的速率、靜脈滴注的輸液管道種類、輸注壓力，以及給藥環(huán)境條件（如溫度、光照等）和時間等。對于在使用過程中需要復蘇、稀釋、混合和/或暫存的樣品，需開展研究來支持產品在使用貯存期的穩(wěn)定性。使用穩(wěn)定性研究中，還需關注操作過程中引入微生物污染的風險。根據使用穩(wěn)定性研究數據合理擬定產品解凍或臨床配伍后的放置條件和時間。

       （四）貯存條件標識

       根據穩(wěn)定性研究結果，需在產品說明書和/或標簽中明確產品的貯存條件和有效期。不能冷凍的產品需另行說明。若產品要求防輻射或避免凍融等，建議在各類容器包裝的標簽和說明書中注明。

       九、包裝及密封容器系統

       為避免生產過程中接觸樣品的材料、存儲容器和包裝材料對免疫細胞治療產品質量產生非預期影響，需對其進行安全性評估、相容性研究和功能適用性研究。

       安全性評估方面，需對材質成分及其來源、生產工藝過程可能引入的風險（如適用）和質量控制等進行充分的安全性評估?？刹捎霉虒Πb材料進行的基本性能測試和生物安全性評估等結果作為參考依據。

       相容性研究方面，其基本原則可參照一般生物制品包材相容性研究的要求?；陲L險評估，可對直接接觸的材料或容器開展可提取物/浸出物研究，并進行安全性評估。研究中需充分評估相容性風險較高的成分（如輔料 DMSO）與材料或容器的相互作用等。

       功能適用性方面，一般可考慮容器密閉性/密封性、冷凍適用性等方面的研究等。

       另外，對于運輸用的次級包裝容器（非直接接觸細胞） 或材料也應開展驗證研究，研究的項目包括但不限于保溫性、密封性、抗機械壓力和遮光性（如需要）等方面。