嵌合抗原受體T細(xì)胞（(CAR-T）療法在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療中取得了一定的突破，但是同期PD-1產(chǎn)品，僅Keytruda在2021年就實現(xiàn)170多億美元的營收，但是與此相比所有上市的CAR-T產(chǎn)品2021年總營收也難望其項背。原因很多（治療費用高昂、產(chǎn)能不足等），其中重要的一個因素是適應(yīng)癥局限于血液瘤，且大部分都是末線治療。所有針對實體瘤的CAR-T還處于探索階段，目前CAR-T治療在實體瘤中面臨著很多挑戰(zhàn)，包括免疫抑制性腫瘤微環(huán)境（TME）、腫瘤抗原異質(zhì)性、基質(zhì)障礙和腫瘤可及性，以及靶向/脫靶等困境。

       A 抑制性腫瘤微環(huán)境

       與血液系統(tǒng)惡性腫瘤不同，實體瘤中癌細(xì)胞的可及性受到限制，其中還包括一些物理障礙，比如腫瘤脈管系統(tǒng)和細(xì)胞外基質(zhì)，這些會阻礙注入的CAR-T細(xì)胞滲透到腫瘤組織。實體瘤是一種器官樣、雜亂無章的結(jié)構(gòu)，由增殖的腫瘤細(xì)胞組成，周圍有支持性基質(zhì)細(xì)胞和滋養(yǎng)腫瘤新血管系統(tǒng)的血管，腫瘤的生長可以由先天性和適應(yīng)性成分控制。實體瘤中先天免疫細(xì)胞主要有：中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞（DC）、肥大細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）和髓源性抑制細(xì)胞（MDSC）。適應(yīng)性免疫細(xì)胞：T和B細(xì)胞以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）。所有這些免疫細(xì)胞都與構(gòu)成TME的非腫瘤基質(zhì)細(xì)胞相關(guān)：內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞。上述這些細(xì)胞及其分泌的因子和分子構(gòu)成了TME。CAR-T細(xì)胞在實體惡性腫瘤治療中遇到的主要障礙，是TME通過抑制性可溶性因子和過度表達陰性免疫檢查點來阻止T淋巴細(xì)胞向腫瘤運輸和滲透建立免疫抑制環(huán)境，T細(xì)胞有效浸潤到腫瘤基質(zhì)中是保持被注入T細(xì)胞的抗腫瘤活性和癌癥免疫治療成功的關(guān)鍵步驟。

       圖1 腫瘤免疫抑制微環(huán)境

       ?腫瘤微環(huán)境缺氧

       （1）缺氧是影響腫瘤進展并改變癌癥患者治療結(jié)果的腫瘤微環(huán)境的標(biāo)志。缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）的穩(wěn)定性和核轉(zhuǎn)位，它通過與缺氧誘導(dǎo)基因啟動子中的缺氧反應(yīng)元件（HRE）區(qū)域結(jié)合來進一步調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境變化。另一方面，感染和炎癥過程中產(chǎn)生的T細(xì)胞受體（TCR）激活信號或細(xì)胞因子可以調(diào)節(jié)HIF的合成和穩(wěn)定性，進而影響T淋巴細(xì)胞的激活和分化。在持續(xù)感染或腫瘤微環(huán)境下，TCR介導(dǎo)的T細(xì)胞刺激和缺氧條件增加了HIF豐度和細(xì)胞**T淋巴細(xì)胞（CTL）的效應(yīng)功能。這時，Von Hippel-Lindau （VHL）因子會部分抑制T細(xì)胞反應(yīng)，以保護身體免受過度反應(yīng)的破壞性。T淋巴細(xì)胞中HIF1α的穩(wěn)定與糖酵解酶（如作為葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的GLUT-1）表達的增強和氧化磷酸化速率的降低平行，因此可以通過缺氧依賴和缺氧非依賴途徑增加HIF水平和活性，作為代謝途徑的調(diào)節(jié)劑，并參與T細(xì)胞增殖、分化和效應(yīng)活性。

       （2）缺氧會促進三磷酸腺苷（ATP）分解和抑制腺苷激酶（將腺苷磷酸化位AMP），從而導(dǎo)致腺苷增強。腫瘤微環(huán)境中低氧來源積累的腺苷與T細(xì)胞表達的特定受體（即A2AR和A2BR）的相互作用會干擾TCR信號傳導(dǎo)，從而抑制T細(xì)胞的抗腫瘤活性。重要的是，腺苷和G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）的相互作用激活蛋白酶A（PKA），后者隨后調(diào)節(jié)TCR下游信號傳導(dǎo)。如果CAR-T細(xì)胞表達RIAD（調(diào)節(jié)亞基I錨定破壞肽）能阻止PKA在免疫突觸中的定位，可以削弱腺苷對間皮素-CAR-T細(xì)胞活性的抑制作用；另外使用小分子如BAY 60–6583（腺苷A2B受體激動劑）可以通過影響多個靶點來提高CAR-T細(xì)胞的治療效果。

       （3）免疫檢查點PDL1分子以HIF-1α依賴方式上調(diào)，缺氧的環(huán)境阻礙了浸潤T細(xì)胞的功能。通過PD1阻斷消除PD1與PDL1的相互作用可以增強腫瘤浸潤T淋巴細(xì)胞上A2AR的表達，導(dǎo)致對積累的腺苷免疫抑制的敏感性增強。因此同時靶向PD1/PDL1軸和腺苷A2A（通過遺傳或藥理學(xué)方法），可以改善CAR-T細(xì)胞治療中的T細(xì)胞性能。

       B 限制進入腫瘤細(xì)胞

       ?細(xì)胞外基質(zhì)

       細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）作為腫瘤周圍基質(zhì)的一部分，由纖維蛋白、糖蛋白、多糖和蛋白聚糖組成。惡性組織中ECM成分的表達和密度增加，特別是透明質(zhì)酸和膠原蛋白的過度產(chǎn)生和沉積，阻礙了治療劑的滲透。此外膠原蛋白密度升高會損害T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞毒活性，并誘導(dǎo)調(diào)節(jié)表型，而且CAR-T細(xì)胞制造的策略也可能造成ECM降解酶表達下調(diào)。鑒于這些事實，應(yīng)用ECM降解酶（如透明質(zhì)酸酶和膠原酶）可以降低ECM硬度并促進抗癌劑的輸送。Caruana及其同時在CAR修飾的T細(xì)胞中誘導(dǎo)乙酰肝素酶 (HPSE) 表達，從而提高了共表達 CAR T細(xì)胞（即表達的CAR和HPSE）ECM降解能力和抗腫瘤活性。

       ?腫瘤血管

       癌細(xì)胞的細(xì)胞分裂不受控制，需要形成新的血管來獲取營養(yǎng)和氧氣。異常脈管系統(tǒng)的發(fā)展，以及參與T細(xì)胞外滲的黏附分子的下調(diào)（在bFGF和VEGF等血管生成因子的影響下），成為T細(xì)胞滲透到腫瘤床的物理屏障。此外，腫瘤微環(huán)境中的內(nèi)皮細(xì)胞促進FasL和抑制性分子（如PD-L1、TIM3、IDO-1、PGE2和IL-10）的表達，從而抑制效應(yīng)T細(xì)胞活性。腫瘤血管的這些特征部分依賴于VEGF產(chǎn)生及其受體的過度表達。因此針對VEGFR1和VEGFR2 設(shè)計的CAR，通過限制營養(yǎng)和氧氣來破壞腫瘤血管和減少腫瘤細(xì)胞增殖方面顯示出不錯的效果。因此，可以通過同時輸注VEGFR2特異性CAR-T細(xì)胞和抗原特異性TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T 細(xì)胞，增加腫瘤特異性T細(xì)胞的浸潤、持久性和抗腫瘤活性來改善腫瘤特異性免疫治療的結(jié)果。

       圖2 增強腫瘤運輸和滲透的策略

       ?癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞

       癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）是腫瘤基質(zhì)中最豐富的成分之一，代表了一種反應(yīng)性的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞群，它分泌各種活性因子（VEGF和PDGF），促進腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和治療抵抗。CAF表達可以被免疫療法靶向各種分子，其中FAP是最有希望的靶點。它是一種細(xì)胞表面絲氨酸蛋白酶，在人類各種癌癥的相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞（CASC）上高度表達，例如：肺癌、前列腺癌、胰 腺癌、結(jié)腸直腸癌和卵巢癌。下圖中描述的策略靶向CAF的關(guān)鍵信號和效應(yīng)器，旨在抑制CAF的功能，例如細(xì)胞因子 (TGFβ) 和生長因子途徑 (VEGF、PDGF)。如，可以用單克隆抗體 (MAb) 靶向CAF衍生的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（MMP）和相關(guān)信號傳導(dǎo)，以誘導(dǎo)基質(zhì)耗竭和增加免疫T細(xì)胞浸潤。FAP靶向旨在阻斷CAF在TME中發(fā)揮腫瘤促進作用的能力，可以通過使用MAb/抗體-藥物偶聯(lián)物、免疫偶聯(lián)物或肽-藥物復(fù)合物、FAP特異性CAR-T細(xì)胞或基因敲除策略來完成。

       圖3 抵消 CAF 致瘤效應(yīng)的策略

       C 存在免疫抑制細(xì)胞

       ?調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

       Tregs參與腫瘤的免疫抑制環(huán)境，具有免疫抑制特征，例如分泌IL-10和TGF-β，以及競爭效應(yīng)T細(xì)胞增殖所需的IL-2，抑制了注入的T細(xì)胞功能。Tregs是高度依賴IL-2的免疫抑制細(xì)胞。它們與周圍環(huán)境中的IL-2結(jié)合并將其耗盡，從而通過組成表達高親和力IL-2受體（IL2R）亞基-α（CD25）來降低T細(xì)胞的可用性。Treg細(xì)胞還產(chǎn)生免疫抑制細(xì)胞因子（IL-10、IL-35和TGFβ），它們可以下調(diào)T細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞（APC）的活性。此外，Treg細(xì)胞釋放大量ATP，ATP 轉(zhuǎn)化為腺苷（通過CD39和CD73），可為T細(xì)胞和APC提供免疫抑制信號。

       目前來消除Treg介導(dǎo)的免疫抑制機制策略主要是CAR-T細(xì)胞被設(shè)計用于靶向Treg 表達的抗原將其直接消耗。其他策略基于TME的免疫調(diào)節(jié)以提高CAR-T細(xì)胞的性能：（i）CAR-T細(xì)胞表達促炎細(xì)胞因子；（ii）優(yōu)化共刺激信號結(jié)構(gòu)以減少IL-2分泌并削弱Treg擴增和腫瘤浸潤。最后一種策略就是賦予CAR-T細(xì)胞對免疫抑制的內(nèi)在抵抗力：（i）旨在破壞信號傳導(dǎo)的顯性負(fù)性受體 (DNR)，或 （ii）嵌合開關(guān)受體 (CSR或Switch R) 將負(fù)信號轉(zhuǎn)化為正信號，或通過使用基因組編輯工具（敲除）消除抑制性受體（如 TGFβ 受體的 PD1）的表達。

       圖4

       Treg 在 TME 中發(fā)揮免疫抑制的機制 (A)，

       克服 Treg 誘導(dǎo)的免疫抑制的策略（B）

       ?腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）

       巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細(xì)胞之一，在先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用，構(gòu)成抵御外來病原體的第一道防線，并有助于觸發(fā)適應(yīng)性抗原特異性反應(yīng)。巨噬細(xì)胞可以分為兩個對比組：經(jīng)典激活的巨噬細(xì)胞或M1巨噬細(xì)胞（促炎和抗腫瘤）和交替激活的巨噬細(xì)胞或M2巨噬細(xì)胞（抗炎和促腫瘤）。這種差異主要是由于暴漏于組織的可溶性因子或病原體衍生分子而引起極化。M1巨噬細(xì)胞是促炎細(xì)胞，通過分泌TNFα、IL-1β 和 IL-12 將細(xì)胞免疫定向到 TH1型反應(yīng)在抗腫瘤免疫中發(fā)揮作用。盡管M2巨噬細(xì)胞在組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用（刺激Th2反應(yīng)以消除寄生蟲、免疫調(diào)節(jié)、傷口愈合和組織修復(fù)），但M2巨噬細(xì)胞也可以促進腫瘤進展。

       腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，這些因子可將巨噬細(xì)胞募集到腫瘤細(xì)胞周圍并將它們轉(zhuǎn)化為TAM。當(dāng)巨噬細(xì)胞被招募遷移至腫瘤間充質(zhì)中后，可以通過改變自身的表型，來適應(yīng)它們所處的微環(huán)境。TAM是位于TME中的M2樣巨噬細(xì)胞的特殊群體，與M1和M2巨噬細(xì)胞具有一些共同的表型特征，但具有不同于這兩種類型的特定轉(zhuǎn)錄譜。TAM通過促進遺傳不穩(wěn)定性和增強血管生成、纖維化、侵襲、免疫抑制和淋巴細(xì)胞排斥來增強腫瘤進展和轉(zhuǎn)移。一方面，巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，如IL-17和IL-23，這增加了遺傳不穩(wěn)定性，另一方面，它們通過分泌抑制細(xì)胞因子如TGF-β和IL-10，通過表達免疫檢查點配體如PD-L1、PD-L2、B7-H4 或VISTA或通過產(chǎn)生活性氧（ROS）,可以阻礙腫瘤免疫監(jiān)視，從而阻礙T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫。

       圖5 克服 TAM 在 TME 中引起抑制的策略

       目前針對巨噬細(xì)胞的各種治療策略旨在耗盡或者重新極化巨噬細(xì)胞。

       第一種方法是通過消除現(xiàn)有的TAM或通過抑制進一步的TAM募集來減少或消耗TAM，這種策略主要通過定位（i）集落刺激因子1 (CSF1)/CSF1 受體 (CSF1R) 信號通路，（ii）趨化因子/趨化因子受體軸，例如CCL2/CCR2、CCL5/CCR5，（iii）IL-8/CXCR2或（iv）CXCL12 /CXCR4軸實現(xiàn)。

       第二種方法是通過抑制PI3Kγ信號通路，通過TLR激動劑觸發(fā)炎癥激活Toll 樣受體（TLR：TLR3、TLR4、TLR7/8和TLR9）信號通路，將TAM重新極化為M1樣表型，或者通過使用激動性抗體CD40抗體實現(xiàn)。也可以通過阻斷被稱為“don’t eat me”信號的抗吞噬表面蛋白（如SIRPα 或 Siglec-10）來促進TAM的抗原呈遞和吞噬作用，同時抗體阻斷癌細(xì)胞上表達的CD47或CD24。

       第三種靶向TAM的分子是TGF-β，它是一種抗炎細(xì)胞因子，通常在損傷消退期間由巨噬細(xì)胞表達。巨噬細(xì)胞既是TGF的來源也是靶點，通過促進額外TGF-β的分泌，引起TAM的正反饋回路并維持免疫抑制性TME。通過TGF-β阻斷靶向TAM已經(jīng)被使用，也可與STING 激動劑或抗PDL1阻斷聯(lián)合使用，并在臨床前模型中顯示腫瘤消退。

       第四種方法就是增強腫瘤細(xì)胞吞噬作用，最新的研究強調(diào)了多種抗原靶向的重要性，它既可以提高CAR-T細(xì)胞治療的有效性，又可以減少脫靶反應(yīng)，例如生成具有靶向CD47和TAG-72的兩個串聯(lián)CAR的CAR-T細(xì)胞。雙重靶向策略使CAR-T細(xì)胞破壞表達低抗原水平的腫瘤細(xì)胞的能力增強，有利于增加串聯(lián)CAR與腫瘤細(xì)胞的親和力。有的研究者研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)工程改造的NanoCAR-T 細(xì)胞可分泌抗CD47納米抗體能夠抑制腫瘤生長，同時避免全身抗CD47治療遇到的**。與標(biāo)準(zhǔn)CAR-T細(xì)胞相比，這種TAM重編程策略顯示出優(yōu)異的抗腫瘤活性。

      ?髓源性抑制細(xì)胞

       MDSC是具有免疫抑制性未成熟的骨髓細(xì)胞。根據(jù)形態(tài)和細(xì)胞表面抑制物分為兩種亞型：單核細(xì)胞MDSC (M-MDSC) 和多形核/粒細(xì)胞MDSC (PMN-MDSC)。它們通過誘導(dǎo)Tregs和產(chǎn)生精氨酸酶（ARG1）、誘導(dǎo)型NOS（iNOS）和抑制性細(xì)胞因子如 IL-10 和 TGF-β，有助于產(chǎn)生腫瘤免疫抑制環(huán)境。目前增加CAR-T細(xì)胞對MDSC免疫抑制作用抵抗的策略：（i）防止 MDSC 分化和募集到腫瘤床；（2）消耗腫瘤浸潤性MDSC或（3）減輕MDSC的免疫抑制作用。

       圖6

       MDSC在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮免疫抑制機制(A),

       克服 MDSC 誘導(dǎo)的免疫抑制的策略（B）

       D 免疫檢查點分子和免疫抑制介質(zhì)的表達

       免疫檢查點（IC）通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的時間進程和強度，確保維持免疫穩(wěn)態(tài)。然而，來自IC的基于受體的信號級聯(lián)在T細(xì)胞中發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用，通過誘導(dǎo)免疫耐受，從而使腫瘤逃避免疫監(jiān)視。第一個被確定為T細(xì)胞和CAR-T細(xì)胞抑制和凋亡的重要受體的主要IC是CTLA-4和PD-1。在癌癥中廣泛研究的其他免疫受體還有 LAG-3、TIGIT、T細(xì)胞免疫球蛋白和含有蛋白3 (TIM3) 的粘蛋白以及B和T淋巴細(xì)胞衰減劑 (BTLA)。由于PD1/PD-L1抑制是研究最多的軸，我們來主要關(guān)注一下CAR-T細(xì)胞治療中的PD-1/PD-L1抑制。

       PD-1是B7/CD28家族的成員，它通過與兩種配體PD-L1和PD-L2相互作用發(fā)揮調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性的作用。PD-1/PD-L1結(jié)合阻礙IFN-γ和IL-2的合成，從而降低T細(xì)胞增殖。為了防止TME中的CAR-T細(xì)胞衰竭和免疫抑制可以使用不同的策略，比如：（i）CAR-T細(xì)胞與免疫檢查點抑制劑（ICI，如抗 PD1 或 PD-L1抗體）的組合；（ii）PD1 介導(dǎo)的抑制也可以通過設(shè)計分泌 PD-1 阻斷或 PD-L1阻斷 單鏈可變片段（scFv）的 CAR-T 細(xì)胞來克服；（iii）設(shè)計基因修飾的CAR-T細(xì)胞，該細(xì)胞表達顯性負(fù)PD-1受體 (PD-1 DNR)，干擾PD1下游信號傳導(dǎo)或PD-1嵌合開關(guān)受體（CSR），將抑制信號轉(zhuǎn)變成激活信號。（iv）最后一種策略通過基因敲除或通過shRNA（短發(fā)夾 RNA）抑制使PD1表達缺失。

       圖7 CAR-T 細(xì)胞克服負(fù)性免疫檢查點調(diào)節(jié)抑制作用的策略（PD1/PD-L1為例）

       總之：腫瘤血管系統(tǒng)和細(xì)胞外基質(zhì)等惡性組織的特定性阻礙了CAR-T細(xì)胞的滲透，另一方面，調(diào)節(jié)細(xì)胞的存在、免疫檢查點的過分表達和TME的缺氧條件會耗盡過繼轉(zhuǎn)移的T細(xì)胞削弱其抗腫瘤活性。目前所有針對實體瘤的CAR-T還處于探索階段，并面臨著很多的挑戰(zhàn)。期待著早日攻克這些難題。