CAR-T治療究竟貴在哪里。

       CAR-T療法：是指通過(guò)基因克隆技術(shù)對具有免疫球蛋白（Ig）的抗原結合區的T細胞受體進(jìn)行基因改造，將帶有特異性抗原識別結構及T細胞激活信號的遺傳物質(zhì)轉入T細胞，使T細胞直接與腫瘤細胞表面的特異性抗原相結合而被激活。CAR識別腫瘤抗原后，激活T細胞的免疫通路，相關(guān)基因表達上調，分泌顆粒酶、穿孔素等物質(zhì)直接介導腫瘤細胞溶解，同時(shí)分泌粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、干擾素-γ（IFNγ）等炎癥因子，招募巨噬細胞等固有免疫細胞響應殺傷腫瘤組織，從而治療癌癥。

       CAR分子結構：CAR主要由識別腫瘤特異性抗原的單鏈抗體（scFV）段、鉸鏈區及跨膜段、共刺激分子結構域、CD3ζ結構域構成。通過(guò)將編碼CAR的基因引入T細胞，從最初一代CAR-T細胞發(fā)展到目前的第四代CAR-T細胞經(jīng)歷了30年的發(fā)展時(shí)間。

       圖1 CAR-T細胞結構演變

       表1 四代CAR-T細胞結構的發(fā)展

       01

       CAR-T制備流程復雜，耗時(shí)較長(cháng)

       目前上市的CAR-T產(chǎn)品均為自體細胞來(lái)源，自體CAR-T制備首先將病人的白細胞（WBCs）通過(guò)血細胞去除法分離后洗滌獲得。然后，T細胞被激活，轉導CAR基因，擴增到一定數量后罐裝和密封后用于治療。CAR-T細胞制備主要包括以下步驟：

       圖2 臨床規模自體CAR-T細胞療法的制備過(guò)程

       （1）單采白細胞及細胞清洗

       在CAR-T療法中患者的白細胞需要先被從體內提取出來(lái)之后，對之加以改造使其表達CAR-T，而后再輸回患者體內。由于白細胞重量異于其他血液成分，利用密度梯度離心法從患者（已上市產(chǎn)品）或健康志愿者（發(fā)展趨勢）外周血中分離白細胞，常用的血液成分分離機包括：Trima、UVAR-XTS、COBE Spectra，之后洗滌去除白細胞分離過(guò)程中添加的抗凝劑。

       （2）富集T細胞并激活

       生產(chǎn)CAR-T時(shí)所用的T細胞富集手段一般是單抗磁珠富集法，T細胞通過(guò)CD4/CD8特異性抗體或者表面標記偶聯(lián)磁珠進(jìn)行分離，然后加入CD3/CD28單克隆抗體磁珠或人工抗原提呈細胞等對細胞培養基中的T細胞進(jìn)行激活，這其實(shí)是模擬正常身體環(huán)境中樹(shù)狀細胞對休眠T細胞的刺激，并使其迅速活化。因為僅有活化后的T細胞能夠快速分裂，且T細胞僅在活化后方能針對某一特定抗原分泌大量抗體。

       （3）基因傳遞/轉染

       這是制備CAR-T的關(guān)鍵，使用慢病毒/逆轉錄病毒載體或非病毒方法（電轉DNA、轉座子/轉座子系統）將CAR轉染到T細胞中，CAR基因是T細胞準確識別腫瘤細胞的“眼睛”，載體的導入效率影響著(zhù)CAR-T產(chǎn)品的成本和質(zhì)量。理想的載體應具有較高的基因轉染效率，穩定性好，不引起機體免疫反應等特點(diǎn)，目前已開(kāi)展的臨床試驗以病毒載體轉導為主。

       圖3 CAR基因的導入的主要方式

       γ-逆轉錄病毒載體是第一個(gè)用于人類(lèi)的基因轉導系統，臨床應用未發(fā)生與基因插入誘變相關(guān)的不良反應，它屬于一種RNA病毒。首先需要通過(guò)將包裝有CAR基因序列和LTR序列、gag和pol基因系列、env基因系列的三個(gè)質(zhì)粒導入宿主細胞，通過(guò)宿主細胞的細胞器復制/轉錄出病毒蛋白和所需的基因序列，并包裝成攜帶CAR基因的γ-逆轉錄病毒載體。載體和活化的T細胞膜融合后，釋放CAR基因，沿著(zhù)微管被運輸到細胞核（得益于核膜被破壞），并整合進(jìn)T細胞基因組之后進(jìn)行轉錄表達得到CAR蛋白。

       慢病毒載體相對γ-逆轉錄病毒轉導質(zhì)量更加，因而在臨床上應用最多，但是由于二者為隨機整合，仍然存在一定的安全風(fēng)險；慢病毒載體具有更高的寄送效率和T細胞轉導質(zhì)量，慢病毒傳染的CAR-T顯示出更顯著(zhù)的抗腫瘤效力，是目前的主流遞送載體，轉染過(guò)程與逆轉錄病毒類(lèi)似。可轉導靜止和活化的T細胞，轉到效率接近100%，轉基因負荷量可達8kb，基因**更小，整合位點(diǎn)相比γ-逆轉錄病毒更安全但成本更高。

       目前絕大多數CAR-T細胞CAR的轉染都是基于病毒載體，但是病毒載體的制造過(guò)程復雜，成本昂貴且受到嚴格控制。監管上病毒載體在臨床試驗的早期階段難以符合GMP（藥物質(zhì)量管理規范）的所有方面。因此，以轉座子技術(shù)的非病毒基因傳遞是研發(fā)熱點(diǎn)，轉座子系統發(fā)生基因整合具有一定的靶向性，且成本低，有較大的潛力發(fā)展成為臨床通用的T細胞基因轉導系統。轉座子基因載體由一個(gè)攜帶CAR（轉座子）的質(zhì)粒和一個(gè)攜帶轉座子酶的質(zhì)粒組成，質(zhì)粒經(jīng)電穿孔進(jìn)入T細胞，轉座酶被表達后作用于CAR側翼的末端導致重復序列，導致在T細胞基因組的TA二核苷酸序列上進(jìn)行切除和整合，插入CAR基因，轉錄表達后在細胞表面生成CAR。目前有基于Sleeping Beauty(SB，“睡美人”)轉座系統和基于PiggyBac(PB)的轉座系統。

       mRNA電穿孔是將CAR基因導入T細胞最簡(jiǎn)單和最安全的方法，但是mRNA的不穩定性要求進(jìn)行多次的T細胞輸注。

       表2 CAR基因轉導方法對比

       （4）細胞擴增培養

       通過(guò)生物反應器等細胞培養設備對T細胞進(jìn)行擴增培養。患者身上只能分離少量的淋巴細胞，大多數有白細胞減少癥和其他并發(fā)癥，需要將適宜的T淋巴細胞擴增以達到治療目的。有許多患者最終無(wú)法接受CAR-T治療，原因就在于這些患者的T細胞無(wú)法在體外充分擴增，未達到目標劑量。CAR-T細胞擴增需要一個(gè)封閉、自動(dòng)化和受控的擴增平臺。細胞培養可以通過(guò)不同的容器進(jìn)行擴增，包括T瓶、平板或培養袋以及生物反應器。利用搖擺式生物反應器（例如WAVE）進(jìn)行擴增是目前主要的培養方式，除此之外，自動(dòng)化的細胞培養生產(chǎn)設備（例如CliniMACS Prodigy）也能夠產(chǎn)生大量的CAR-T，這種自動(dòng)化的設備比起搖擺式生物反應器大大減少人為操作。

       圖4 T細胞培養過(guò)程

       （5）冷凍及運輸，最終回輸患者

       根據配方調整細胞數和培養基成分，然后將產(chǎn)品轉移到合適的容器中進(jìn)行冷凍及運輸，最終回輸到患者。將復制擴增好的T細胞用靜脈輸液的方式輸入患者體內，有效增加血液內殺傷性T細胞的數量，識別腫瘤細胞起到有效殺滅腫瘤細胞的目的。聯(lián)合靜脈輸注+局部注射CAR-T細胞治療復發(fā)性彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）結外病變，患者獲得持久緩解，無(wú)嚴重不良反應，靜脈輸液+局部注射可能成為部分患者更優(yōu)回輸途徑。

       02

       CAR-T細胞復雜的制備工藝帶來(lái)高昂成本

       CAR-T細胞規模生產(chǎn)中的影響因素

       根據已披露的臨床試驗，CAR-T療法從白細胞采集到回輸的時(shí)間大多在10-25天左右，獲取并激活T細胞耗時(shí)1天，載體轉染耗時(shí)2天，擴大培養耗時(shí)7天左右，制備及質(zhì)控耗時(shí)3天左右。其中Kymriah制備耗時(shí)為22天，Yescarta為17天。雖然目前的細胞療法開(kāi)發(fā)過(guò)程中基本方案類(lèi)似，但是工業(yè)界還沒(méi)有開(kāi)發(fā)出一個(gè)成熟的，完全可被接受的CAR-T生產(chǎn)工藝，許多CAR-T產(chǎn)品使用人工操作，非常耗時(shí)耗力，而且難以擴大，失敗率高。整個(gè)CAR-T制備工藝非常復雜，而相對應的其生產(chǎn)工藝過(guò)程的優(yōu)化卻較為緩慢。

       如前所述，相當大的可變因素可能會(huì )阻礙CAR-T細胞的制造，CAR-T細胞制造中變異的主要來(lái)源——

       （A）操作變異(方法、人員、設備)：這主要是操作員/操作設備變化的結果，特別是在使用手動(dòng)式處理系統時(shí)，完全自動(dòng)化的制造程序可以將操作變異帶來(lái)的影響降至最低；

       （B）原材料和試劑（血清、培養基、生長(cháng)因子等）：用于更好實(shí)現細胞擴增的培養基和試劑（例如細胞生長(cháng)因子）目前尚未標準化，原材料和試劑如果根據GMP規范制造可能難以獲得；

       （C）環(huán)境變量（溫度、粒子數、氣體張力、濕度）：在CAR-T細胞制造過(guò)程中應監測環(huán)境參數以確保制造過(guò)程一致性，確保產(chǎn)品質(zhì)量和無(wú)菌性，在理論上這些方面可以通過(guò)功能封閉的系統實(shí)現；

       （D）生物因素（起始材料質(zhì)量和組成）：這是最重要的因素。生物因素是CAR-T細胞制造中不可避免的變量 ，其中最重要的可變性包括：細胞活力、T細胞含量、健康狀況和表型。

       另外不同患者的輔助細胞也會(huì )有很大的差異，例如巨噬細胞和單核細胞。但是細胞治療產(chǎn)品質(zhì)量控制的安全性、純度、效力以及均一性會(huì )貫穿CAR-T生產(chǎn)的各個(gè)階段，這也增加了CAR-T治療的成本。

       圖5 CAR-T細胞規模生產(chǎn)中的變量

       CAR-T細胞制備的成本構成，耗材占用總成本的一半

       Kymriah在美國定價(jià)為47.5萬(wàn)美元/針，Yescarta在美國定價(jià)為37.3萬(wàn)美元/針，在中國上市的奕凱達和倍諾達的價(jià)格為120萬(wàn)元/針和129萬(wàn)元/針。CAR-T價(jià)格高昂主要是由針對患者的個(gè)性化定制帶來(lái)的極高生產(chǎn)成本導致。

       根據發(fā)表在《international journal of cancer》的文獻報道，生產(chǎn)單人份CAR-T細胞成本約為8萬(wàn)美元。在CAR-T的整個(gè)生產(chǎn)流程中，占用成本最多的是培養及轉導CAR-T所用的培養液、質(zhì)粒、核酶、病毒載體等耗材，占用了成本的約49~51%，具體金額在5萬(wàn)美元/針左右。CAR-T的生產(chǎn)與化學(xué)成分生產(chǎn)與控制（CMC）水平相關(guān)，以激活所使用的CD3/CD28beads為例，一管約在8萬(wàn)元，制備一份CAR-T細胞需使用1/4~1/3，若CMC要求高，則剩余的beads都不能再使用，這也將造成成本的增加。所用病毒載體的GMP生產(chǎn)約占總成本的30%，當對病毒載體的需求量增大時(shí)，可降低CAR-T細胞制備的生產(chǎn)成本，以葛蘭素史克的慢病毒載體生產(chǎn)為例，生產(chǎn)100劑CAR-T慢病毒載體時(shí)，成本約為2.5萬(wàn)美元/劑，生產(chǎn)1000劑時(shí)，成本約為4000美元/劑；生產(chǎn)10000劑時(shí)，成本約為1500美元/劑。其次是質(zhì)控過(guò)程測量CAR-T產(chǎn)品無(wú)菌水平、細胞存活、CAR表達水平等所需的耗材，占用總成本的24~25%，具體金額約為2.5萬(wàn)美元/針。目前影響CAR-T生產(chǎn)成本最大的兩項因素是產(chǎn)能利用率和病毒載體，提升生產(chǎn)規模和降低基因轉導載體的成本是降低CAR-T成本最有效的方式。

       圖6 CAR-T生產(chǎn)成本分析（Kymriah為例）

       總之：CAR-T治療復雜的工藝以及針對患者的個(gè)性化定制是導致成本高昂的主要原因，限制了產(chǎn)品臨床試驗的推進(jìn)和可及性。但是CAR-T細胞療法治療在臨床應用的開(kāi)展至今不過(guò)短短十幾年時(shí)間，隨著(zhù)CAR-T細胞結構的逐步改進(jìn)和完善，開(kāi)發(fā)同種異體CAR-T已經(jīng)成為該療法下一步的發(fā)展方向。通用型CAR-T(UCAR-T)可實(shí)現生產(chǎn)流程的規模化和標準化，可將生產(chǎn)成本降低90%，也期待著(zhù)CAR-T治療成本降低來(lái)惠及更多患者。