01

       PROTAC的歷史發(fā)展

       圖1. PROTAC技術(shù)的原理——泛素介導的蛋白降解途徑，來(lái)源：Swatek, Kirby N, and David Komander. “Ubiquitin modifications.” Cell research vol. 26,4 (2016): 399-422.

       2004年的諾貝爾化學(xué)獎授予了發(fā)現泛素調節的蛋白降解途徑的三位科學(xué)家，這是一種泛素-蛋白酶體系統（UPS）參與的蛋白降解途徑。首先通過(guò)消耗1分子ATP激活泛素小分子，使它與一種泛素激活酶E1形成復合物，隨后這個(gè)泛素分子又轉移到了泛素結合酶E2上形成復合物，當泛素連接酶E3識別結合底物蛋白時(shí)，這個(gè)復合物會(huì )緊接著(zhù)和它結合，泛素就會(huì )直接或者間接地從E2轉移到底物蛋白上。

       泛素小分子的羧基端會(huì )和底物蛋白的Lys上的賴(lài)氨酸殘基共價(jià)結合，當這個(gè)泛素傳遞的過(guò)程重復發(fā)生多次后，泛素根據其自身不同的結合位點(diǎn)以一些特定的方式聚集，就會(huì )使這個(gè)底物蛋白被蛋白酶體降解，隨后通過(guò)去泛素化作用，這些泛素分子可以被循環(huán)利用。泛素-蛋白酶體系統是細胞內蛋白質(zhì)降解的主要途徑，參與細胞內80%以上的蛋白降解過(guò)程。

       圖2. PROTAC技術(shù)的基本原理，來(lái)源：Li, Xin, and Yongcheng Song. “Proteolysis-targeting chimera (PROTAC) for targeted protein degradation and cancer therapy.” Journal of hematology & oncology vol. 13,1 50. 13 May. 2020

       本文所介紹的PROTAC這項技術(shù)，全稱(chēng)是PROteolysis-Targeting Chimeras，即靶向蛋白水解的嵌合體，它的原理就是依賴(lài)于這條泛素化的蛋白降解途徑。

       在結構上，PROTAC包括三個(gè)部分：一個(gè)E3泛素連接酶配體和一個(gè)靶蛋白配體，兩個(gè)活性配體通過(guò)特殊設計的“Linker”結構連接在一起，最終形成了三聯(lián)體的“PROTAC”的活性形式，這樣的化學(xué)分子既可以結合E3泛素連接酶，又可以結合胞內蛋白質(zhì)，它相當于一把“雙向抓手”，通過(guò)把靶向的蛋白質(zhì)招募到E3泛素連接酶附近來(lái)實(shí)現靶向蛋白質(zhì)的多泛素化，最后被蛋白酶體識別和降解。

       在這個(gè)過(guò)程中，PROTAC可以循環(huán)使用，因為它本身沒(méi)有跟泛素結合的氨基酸位點(diǎn)，所以不被蛋白酶體降解。

       圖3. PROTAC研究歷史——1995年報道第一個(gè)人工誘導的蛋白降解，來(lái)源：Gosink, M M, and R D Vierstra. “Redirecting the specificity of ubiquitination by modifying ubiquitin-conjugating enzymes.” PNAS vol. 92,20 (1995): 9117-21

       這種人工誘導的蛋白降解最早報道是在1995年，研究者設計出了一系列可以與IgG結合嵌合的E2結合酶，他們的創(chuàng )新思路是把一個(gè)蛋白結合域附加到E2結合酶的C端，從而形成一個(gè)含有靶蛋白結合域的E2嵌合體，這個(gè)嵌合體就會(huì )基于自身的性質(zhì)去特異性識別并且泛素化相應的靶蛋白。

       他們選擇了一種E2結合酶（UBC4）和protein A嵌合，protein A可以特異性識別多種IgG抗體。這種構造的E2嵌合體具有很好的原始E2的活性，可以結合泛素。它能夠顯著(zhù)促進(jìn)靶蛋白IgG的泛素化，這種E2嵌合體的特異性與protein A一致，由于proteinA能夠識別鼠和兔的IgG而不識別山羊的IgG，因此該嵌合體也能夠識別鼠和兔的IgG而不識別山羊的IgG。而且這些人工誘導的泛素化特征是可以被蛋白酶體識別降解的。這項基于E2嵌合體的創(chuàng )新研究，首次實(shí)現人工誘導蛋白降解，為PROTAC技術(shù)奠定了基礎。

       圖4. PROTAC研究歷史——2001年提出PROTAC概念并設計出首 個(gè)PROTAC分子，來(lái)源：Sakamoto, K M et al. “Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation.” PNAS vol. 98,15 (2001): 8554-9.

       2001年，耶魯大學(xué)的Craig Crews教授與加州理工學(xué)院的Ray Deshaies教授聯(lián)手發(fā)表了一篇具有里程碑意義的論文，他們利用含SCFβ-TRCP的E3誘導了MetAp-2的降解，首次引入了靶向嵌合蛋白水解（PROTAC）一詞，他們將他們設計的PROTAC分子命名為PROTAC-1，它的一端是E3連接酶的配體，IκBα 磷酸肽，另一端是靶蛋白MetAP-2配體，血管生成抑制劑ovalicin，利用這把“雙向抓手”，把靶蛋白MetAP-2招募到SCFβ-TRCP上，實(shí)現泛素化和蛋白酶體降解。

       他們成功合成出了這樣的PROTAC-1分子，并且證實(shí)了它降解靶蛋白的能力。當在體系中加入了LLnL(一種蛋白酶體抑制劑時(shí)），降解能力受到抑制，證明了這個(gè)PROTAC-1分子確實(shí)是依賴(lài)蛋白酶體催化靶蛋白的降解。但是PROTAC-1作為第一代PROTAC分子也表現出一個(gè)顯著(zhù)的缺點(diǎn)，它含有一個(gè)分子量比較大的肽類(lèi)的配體，從而限制了它的細胞膜滲透性，同時(shí)它也不具有很好的穩定性，細胞活性低，因此限制了它的可應用性，無(wú)法應用到藥物開(kāi)發(fā)中。

       圖5. PROTAC研究歷史——2008年報道首 個(gè)全小分子PROTAC，來(lái)源：Schneekloth, Ashley R et al. “Targeted intracellular protein degradation induced by a small molecule: En route to chemical proteomics.” Bioorganic & medicinal chemistry letters vol. 18,22 (2008): 5904-8.

       2008年，這個(gè)含有肽的問(wèn)題得到了解決，報道了第一個(gè)全小分子的PROTAC。這項研究中合成了能夠靶向降解雄激素受體（AR）的SARM-nutlin PROTAC小分子，其中Nutlin是一種咪唑啉衍生物，研究中發(fā)現它可以與E3連接酶MDM2的天然底物p53競爭性結合MDM2，因此可以作為E3連接酶配體。

       在細胞實(shí)驗中，將其作用于瞬時(shí)表達AR的HeLa細胞中，發(fā)現這個(gè)小分子表現出比較好的細胞滲透性、穩定性和一定的降解能力，但其細胞活性仍不理想，小分子在10μM濃度下才能有效誘導AR降解，因此仍然限制了它的成藥性。

       圖6. HIF-1α與VHL蛋白相互作用（左）；一類(lèi)具有高親和力的VHL配體（右），來(lái)源：Buckley, Dennis L et al. “Targeting the von Hippel-Lindau E3 ubiquitin ligase using small molecules to disrupt the VHL/HIF-1α interaction.” Journal of the American Chemical Society vol. 134,10 (2012): 4465-8.

       2010-2012年，隨著(zhù)Craig Crews團隊和Alessio Ciulli及其他合作者發(fā)現了更多泛素E3連接酶的結合體，在類(lèi)藥E3結合配體的發(fā)現與優(yōu)化方面，PROTAC取得了重大的進(jìn)展。

       例如發(fā)現了methyle bestatin(MeBS)可以作為IAP E3連接酶配體，產(chǎn)生了IAP-based PROTAC；

       還發(fā)現沙利度胺（thalidomide）這個(gè)明星藥物可以作為CRBN E3連接酶配體，產(chǎn)生了CRBN-based PROTAC。

       2012年，VHL的高親和力擬肽配體被發(fā)現，HIF-1α（缺氧誘導因子）是一種轉錄因子，在缺氧條件下被激活，上調促紅細胞生成素，血管內皮生長(cháng)因子，葡萄糖轉運蛋白，轉鐵蛋白等的表達。它可以與E3連接酶中的VHL相互作用，被泛素化并進(jìn)入蛋白酶體降解途徑。對這條降解途徑的抑制可以有效替代慢性貧血等由于缺乏HIF-1α引起的疾病治療藥物。

       結合以前旨在抑制這條途徑展開(kāi)的VHL抑制劑小分子的設計研究，研究者開(kāi)展了對于VHL配體的篩選和優(yōu)化，獲得了具有高親和力的配體，設計出了VHL-based PROTAC分子。（右圖分子式為一類(lèi)優(yōu)化的VHL配體）

       圖7. ARVINAS公司和Craig Crews教授

       這種把VHL的抑制劑小分子研究應用到PROTAC設計中的組合理念，促成了Craig Crews教授創(chuàng )辦生物技術(shù)公司Arvinas，該公司專(zhuān)注于PROTAC技術(shù)，開(kāi)發(fā)創(chuàng )新藥物，使得PROTAC技術(shù)得以迅速地發(fā)展。Arvinas基于VHL配體設計的PROTAC化合物具有更多類(lèi)藥特性，可以大幅度提高細胞的穿透性，細胞活性可以達到納摩爾級別。

       圖8. PROTAC研究歷史——PROTAC分子在體內實(shí)現催化下調蛋白水平，來(lái)源：Bondeson, Daniel P et al. “Catalytic in vivo protein knockdown by small-molecule PROTACs.” Nature chemical biology vol. 11,8 (2015): 611-7.

       2015年這個(gè)團隊發(fā)表了一項重要研究，他們設計了兩種基于VHL E3 ligase的小分子PROTAC，一種帶有雌激素相關(guān)受體（ERRα）的配體，另一種是RIPK1蛋白激酶的配體，中間通過(guò)linker與高親和性的VHL配體連接，靶蛋白的水平與癌癥、自身免疫性疾病發(fā)病有關(guān)的。

       這兩個(gè)小分子PROTAC都表現出劑量依賴(lài)性，但是當PTORAC小分子濃度過(guò)高時(shí)，會(huì )出現三元復合物中常見(jiàn)的hook effect，降解靶蛋白的能力反而下降。這是因為當PROTAC小分子濃度過(guò)高時(shí)，以形成二元復合物為主，而三元復合物的形成受到了抑制(如上圖)。

       這項研究還證實(shí)了這樣的小分子PROTAC可以通過(guò)注射到小鼠體內，進(jìn)入不同部位，然后降低其體內不同器官中的相應靶蛋白水平。從而說(shuō)明PROTAC能夠劑量依賴(lài)性地下調靶蛋白的水平，并且在小鼠體內有效發(fā)揮作用。

       有了這些研究的基礎，利用PROTAC技術(shù)進(jìn)行小分子藥物開(kāi)發(fā)有了廣闊的前景，但是PROTAC技術(shù)具體是怎么設計元件的，以及如何突破許多瓶頸在體內工作？

       02

       PROTAC設計與工作

       簡(jiǎn)單回顧一下PROTAC的工作原理：由linker連接的兩個(gè)配體分別靶向目標蛋白（POI）和酶E3，拉近兩者距離，以促進(jìn)泛素轉移，從而使POI跳過(guò)常規UPS步驟，“半路出家”走向被蛋白酶體識別、降解的不歸路。箭頭箭柄和兩個(gè)靶標，互相靠近后，產(chǎn)生化學(xué)反應，磨擦出火花——不難看出，PROTAC似乎扮演“丘比特之箭”的角色，盡管這是一支“分手箭”。

       丘比特之箭的一生可分為四個(gè)階段：

       鑄箭，巧婦難為無(wú)米之炊，一支恰到好處的箭是愛(ài)神降臨的資本；

       瞄準，亂點(diǎn)鴛鴦譜將會(huì )釀成悲劇；

       射箭，神仙眷侶的相逢也需要天時(shí)地利；

       箭效，色厲內荏還是內外兼修，只有正確引導結局走向的箭才擁有圓滿(mǎn)一生。

       相應地，PROTAC的設計與工作歷程也可以“四步走”，即對PROTAC的量與質(zhì)的設計、PROTAC靶向性方面的特點(diǎn)、提高PROTAC可控性的策略以及對PROTAC執行力的評估。

       1 鑄箭——PROTAC設計

       PROTAC的自我修養有哪些？簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，合適配體和合適連接體是其達到及格線(xiàn)的第一步。

       配體選擇需因物制宜：對POI保證親和性，對E3還需格外注意其泛素轉移酶活性的保留。連接體則要“揚長(cháng)避短”，盡可能降低對藥物入膜的不利影響，同時(shí)穩定三元復合物，達到“不惹事也不怕事”的效果。

       目前PROTAC設計日臻完善（圖9），干實(shí)驗與濕實(shí)驗結合，借助計算機模擬、藥效實(shí)驗數據以及復合物結構信息有效地挖掘小分子化合物庫，并不斷優(yōu)化藥物。

       圖9. PROTAC研發(fā)流程圖，來(lái)源：Bond, Michael J, and Craig M Crews. “Proteolysis targeting chimeras (PROTACs) come of age: entering the third decade of targeted protein degradation.” RSC chemical biology vol. 2,3 725-742. 19 Mar. 2021, doi:10.1039/d1cb00011j

       其中配體設計與篩選始終是研究熱點(diǎn)。配體類(lèi)別上，除了傳統的經(jīng)改良的小分子化合物，核酸分子也已被開(kāi)發(fā)為POI配體，在靶向轉錄因子方面表現不俗（圖10）。

       配體靶標相互作用上，一方面是相互作用方式，配體能直接或間接結合靶標，比如借助囊泡膜蛋白這一橋梁，配體與囊泡結合，囊泡則靶向POI，從而拉近POI與E3。另一方面則是相互作用強弱。相互作用強意味著(zhù)三元復合物十分穩定，PROTAC對靶標“死心塌地”，甚至“殉情”，淪為“一次性”藥物。相互作用弱雖然提高復合物不穩定的風(fēng)險，但PROTAC可以“快刀斬亂麻”，快速抽身而投入下一輪降解，提高整體降解速率。面臨向穩還是向快的岔路口，近些年來(lái)嶄露頭角的可逆共價(jià)PROTAC或許能夠另辟蹊徑。

       圖10. 靶向轉錄因子的PROTAC工作示意圖，藍紅螺旋即為核酸分子，與轉錄因子直接結合從而拉近E3與POI，圖片來(lái)源：Hu, Zhenyi, and Craig M Crews. “Recent Developments in PROTAC-Mediated Protein Degradation: From Bench to Clinic.” Chembiochem : a European journal of chemical biology, 10.1002/cbic.202100270. 8 Sep. 2021, doi:10.1002/cbic.202100270

       圖11. 兩種高效篩選配體的方法工作示意圖。左圖為chemo proteomic competition，右圖為DNA encoded library。圖片來(lái)源：Bond, Michael J, and Craig M Crews. “Proteolysis targeting chimeras (PROTACs) come of age: entering the third decade of targeted protein degradation.” RSC chemical biology vol. 2,3 725-742. 19 Mar. 2021, doi:10.1039/d1cb00011j

       方法論上，近年出現兩種配體高效篩選的策略（圖3）。一是chemo proteomic competition，它是指對細胞或機體所有蛋白質(zhì)，設置僅有待測配體和待測配體與已知共價(jià)配體競爭性結合的兩個(gè)實(shí)驗組，通過(guò)比較與興趣蛋白結合的兩種配體的比例評估待測配體與蛋白質(zhì)的親和力。

       二是DNA encoded library，即將小分子化合物與DNA連接而對其進(jìn)行“DNA編碼”后再與靶標蛋白混合進(jìn)行親和篩選，最后通過(guò)DNA序列按圖索驥，鎖定潛在配體。通過(guò)工作原理可以初步推斷，兩者分別側重于篩選共價(jià)結合配體和非共價(jià)結合配體。

       PROTAC的元件及其品質(zhì)初步達標后，接下來(lái)要考慮的問(wèn)題是，打造多少支醫藥丘比特之箭恰到好處？由于三元復合物往往呈現鐘形動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)，所以PROTAC與有效復合物并不呈現簡(jiǎn)單的正相關(guān)關(guān)系。

       此外，某些PROTAC形成三元復合物時(shí)具有正協(xié)同效應，加之可循環(huán)PROTAC的“催化”特性，低劑量高療效成為PROTAC的一塊金字招牌。總之，PROTAC設計的質(zhì)與量，在精不在多。

       2 瞄準——PROTAC靶向性

       圖12. PROTAC靶向的POI發(fā)展時(shí)間線(xiàn)，來(lái)源：Bond, Michael J, and Craig M Crews. “Proteolysis targeting chimeras (PROTACs) come of age: entering the third decade of targeted protein degradation.” RSC chemical biology vol. 2,3 725-742. 19 Mar. 2021, doi:10.1039/d1cb00011j

       目前PROTAC已被證明能夠有效降解支架蛋白、蛋白復合體、轉錄因子和undruggable蛋白這四類(lèi)被普遍認為缺少有效結合小分子藥物位點(diǎn)的POI（圖4）。相較于POI“百花齊放”的喜人之勢，VHL、CRBN等從發(fā)展初期就被使用的酶幾乎壟斷了E3連接酶選擇。

       有趣的是PROTAC似乎是一支不鋒利的神箭，低親和力配體也能以較高選擇性靶向目標。這種現象可能是由于“精心設計”的linker對三元復合物起額外的穩定作用，發(fā)揮了上文提到的“不怕事”作用。換言之，只要配體自身實(shí)力尚可，有強大背景加持仍能“出道”——不過(guò)這仍需要精妙的PROTAC設計為基礎。

       3 射箭——PROTAC可控性

       神箭之外，天時(shí)地利也格外重要。

       首先我們要借助外源信號讓PROTAC“伺機而動(dòng)”，定時(shí)起效。一種策略是光控制，它又可分為“光籠法”和“光開(kāi)關(guān)”兩種方法（圖5）。

       前者是在PROTAC的配體上添加“光籠基團”以鈍化正常狀態(tài)下的PROTAC，經(jīng)特定波長(cháng)光照射后“光籠基團”脫落，實(shí)現不可逆的PROTAC啟動(dòng)。

       后者則是在PROTAC的linker中引入偶氮苯基團，切換不同波長(cháng)的光會(huì )改變linker的順?lè )礃嬓停挥幸环N構型有利于三元復合物形成，這樣便形成可逆PROTAC開(kāi)關(guān)。

       胞外信號分子也是一個(gè)有力把手。比如篩選出特定結合位點(diǎn)，使得只有磷酸化的PROTAC才能與POI緊密結合，這樣便能夠通過(guò)定時(shí)添加生長(cháng)因子，經(jīng)系列信號轉導使PROTAC打上磷酸化標簽，作為其“射箭資格證”。

       然而，PROTAC的時(shí)間可控性面臨藥物透膜性變差、光輻射誘變性以及組織特異性差等問(wèn)題。

       圖13. 光控法示意圖。上圖為“光籠法”，橙色圓球即為光籠基團。下圖為“光開(kāi)關(guān)”，藍色部分即為引入的偶氮苯基團。圖片來(lái)源：Bond, Michael J, and Craig M Crews. “Proteolysis targeting chimeras (PROTACs) come of age: entering the third decade of targeted protein degradation.” RSC chemical biology vol. 2,3 725-742. 19 Mar. 2021, doi:10.1039/d1cb00011j

       組織特異性問(wèn)題恰恰與“地利”相對應，即確保PROTAC在目標組織或細胞發(fā)揮作用。形象地說(shuō)，PROTAC和細胞猶如列車(chē)和乘客，對PROTAC的空間性控制則如同防范乘客逃票，一要抓上車(chē)前檢票，二要抓上車(chē)后查票。

       “檢票”，使持有特定marker的細胞攝入PROTAC。比如以腫瘤細胞高表達的葉酸受體為“票據”，使與葉酸結合的PROTAC只能進(jìn)入腫瘤細胞。再比如利用抗原-抗體特異性結合作用，將PROTAC與抗體綁定，靶向特定細胞。

       “查票”，其原理是非目標細胞即便攝取PROTAC，但由于胞內缺少特定E3或蛋白酶體不識別復合物等啟動(dòng)降解的必要條件，無(wú)法搭乘PROTAC這班“死亡列車(chē)”。

       4 箭效——PROTAC執行力

       醫藥丘比特之箭究竟箭效如何？理論上，PROTAC是典型的藥物差等生，在“類(lèi)藥五原則”的及格線(xiàn)外掙扎，且其ADME尚未明朗，很難評估其生物利用度。

       實(shí)驗數據卻顯示PROTAC是一支潛力股。借助各類(lèi)技術(shù)手段從POI降解效果、PROTAC主體地位驗證以及毒副反應檢測三個(gè)角度對PROTAC進(jìn)行評估后，我們往往能夠驚喜地發(fā)現，PROTAC療效高于理論預期。

       03

       PROTAC的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)

       1 PROTAC的優(yōu)缺點(diǎn)

       首先第一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是作用范圍更廣、活性更高、可靶向“不可成藥”靶點(diǎn)。傳統的小分子和抗體等都是通過(guò)“占據驅動(dòng)”的作用模式抑制靶蛋白的功能發(fā)揮治療疾病的作用，這種作用模式需要抑制劑或單抗具備較高的濃度才能夠占據靶點(diǎn)的活性位點(diǎn)，阻斷下游信號通路的轉導。然而，據估計，人類(lèi)細胞中80%的蛋白缺乏這樣的位點(diǎn)。

       圖14. 傳統小分子的“占據驅動(dòng)”，來(lái)源：Science. 2017, 355(6330): 1163-1167.

       PROTAC只是提供結合活性，觸發(fā)靶蛋白與E3酶結合從而引發(fā)降解這一事件，屬于“事件驅動(dòng)(event driven)”，不需要直接抑制目標蛋白的功能活性，藥物不需要與目標蛋白長(cháng)時(shí)間和高強度的結合，因此可以靶向傳統難以成藥的蛋白（undruggable target）由于PROTAC只需要與目標蛋白弱結合就可以特異性地“標記”它，因此，目前蛋白質(zhì)組中80%不可成藥的蛋白可能都能夠用PROTAC技術(shù)來(lái)解決。

       圖15. PROTAC的“事件驅動(dòng)”。Science. 2017, 355(6330): 1163-1167.

       據不完全統計，目前已經(jīng)有超過(guò)100種蛋白被成功降解。這些靶點(diǎn)包括：

       （1）激酶類(lèi)，如RIPK2、BCR-ABL、EGFR、HER2、c-Met、TBK1、CDK2/4/6/9、ALK、Akt、CK2、ERK1/2、FLT3、PI3K、BTK、Fak等；

       （2）BET蛋白，如BRD2/4/6/9；

       （3）核受體，如AR、ER等；

       （4）其他蛋白，如MetAp-2、Bcl-xL、Sirt2、HDAC6、Pirin、SMAD3、ARNT、PCAF/GCN5、Tau、FRS2等。

       這其中就包括“不可成藥靶點(diǎn)”，如轉錄因子調節蛋白pirin、表觀(guān)遺傳相關(guān)蛋白PCAF/GCN5等。另外，根據Nature 3月份的一項報告顯示，到2021年年底，將至少有15款蛋白降解劑（包含PROTAC和分子膠）進(jìn)入臨床試驗。

       講到不可成藥靶點(diǎn)，RAS（KRAS、HRAS和NRAS）肯定是繞不要過(guò)去的。作為癌癥中最常見(jiàn)的突變基因，RAS是肺癌、結直腸癌和胰 腺癌的重要驅動(dòng)因素。被發(fā)現和研究40多年來(lái)，一直沒(méi)有針對該靶點(diǎn)的藥物上市。終于在今年5月份，Amgen公司開(kāi)發(fā)的KRAS-G12C不可逆抑制劑AMG510（Sotorasib）成功上市，總算是終結了該靶點(diǎn)的“不可成藥性”。

       雖然KRAS的不可成藥性被小分子抑制劑終結了，但是降解劑在該靶點(diǎn)仍然大有可為。針對KRAS-G12C突變，Crews等人在KRAS抑制劑AMG510和MRTX849的基礎上，設計并合成了相關(guān)的PROTAC，活性測定發(fā)現了具有良好降解活性的降解劑，這或許可以為進(jìn)一步攻克RAS提供新的解決方案。

       可以預見(jiàn)，利用PROTAC技術(shù)攻克的可能不只是G12C，對其他突變或許也能有所作為。

       圖16. 針對RAS靶點(diǎn)的相關(guān)PROTAC藥物活性測定

       第二個(gè)優(yōu)點(diǎn)是PROTAC在某些靶點(diǎn)上可實(shí)現小分子難以實(shí)現的選擇性。多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑Foretinib可以結合130多種激酶，Crews等人將其作為結合靶蛋白的配體，分別連接E3連接酶VHL（von Hippel-Lindau）和CRBN（cereblon）的配體得到相應的PROTAC，結果顯示連接VHL和CRBN的PROTAC只能分別降解36和62種蛋白，而只有12種蛋白才能被這兩種PROTAC降解。

       2,4-二氨基嘧啶骨架是激酶抑制劑的常見(jiàn)骨架，EGFR、ALK、CDK、Jak等激酶的抑制劑都有用到其作為母核。但是該骨架形成的藥物分子大多都比較“臟”，也就是靶點(diǎn)選擇性比較差，經(jīng)常對其他很多激酶都有很強的抑制活性，開(kāi)發(fā)過(guò)程中off target的脫靶效應常常成為毒副作用的主要來(lái)源，影響新藥開(kāi)發(fā)的成功率。

       Gray課題組基于該骨架合成的PROTAC雖然能夠結合190多種激酶，但是細胞實(shí)驗中只能降解12和22種激酶，大大提高了靶點(diǎn)的選擇性。

       PROTAC技術(shù)第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)是不僅可以實(shí)現小分子抑制劑難以做到的選擇性，在提高活性方面也具有非常顯著(zhù)的優(yōu)勢。以PROTAC技術(shù)應用最早的靶點(diǎn)BET（BRD2/3/4）為例，秦沖等人發(fā)現的QCA570在細胞抗增殖活性方面表現出了明顯優(yōu)于JQ1等抑制劑的能力，JQ1等抑制劑的活性大都在納摩爾級水平，而QCA570的活性提高了三個(gè)數量級，達到了驚人的皮摩爾級水平。基于出色的體外細胞抗增殖活性，降解劑在體內也表現出了強效抗腫瘤活性，而且呈現出給藥劑量低和給藥頻次也低的特點(diǎn)。這說(shuō)明在類(lèi)似BET等靶點(diǎn)中，PROTAC具有明顯的優(yōu)勢。

       圖17. PROTAC可以提高活性和安全性，來(lái)源：J Med Chem 2018, 61, 6685-6704.

       第四個(gè)優(yōu)點(diǎn)是克服藥物的耐藥性。小分子抑制劑或拮抗劑在臨床用藥過(guò)程中，不可避免的都會(huì )發(fā)生獲得性耐藥。比如EGFR-T790M和C797S耐藥等。雖然可以通過(guò)開(kāi)發(fā)新一代的抑制劑，如第三代和第四代EGFR來(lái)解決耐藥問(wèn)題，但是隨著(zhù)新一代藥物的使用，新的耐藥也會(huì )隨之出現。PROTAC技術(shù)在克服耐藥方面已經(jīng)顯現出了一定的優(yōu)勢。

       Crews、Jian Jin、張三奇、丁克和Gray等課題組都有相關(guān)EGFR-PROTACs的研究，旨在通過(guò)蛋白降解途徑克服耐藥突變或找尋突破抑制劑的蛋白降解療法。可以看出，第一、二、三、四代抑制劑作為結合靶蛋白EGFR的配體，都有被應用到PROTAC的設計中。其中，Gray課題組將變構抑制劑也應用到了PROTAC當中，并取得了不錯的效果，能夠選擇性的降解不同的EGFR突變體，而規避對野生型的降解。體外抗細胞增殖活性也進(jìn)一步驗證了這種選擇性。

       圖18. EGFR-PROTACs. [1] Cell Chem Biol 2018, 25, 67-77. [2] J Med Chem 2020, 63, 1216-1232. [3] Eur J Med Chem 2020, 189, 112061. [4] Eur J Med Chem 2020, 208, 112781. [5] Eur J Med Chem 2020, 192, 112199. [6] Angew Chem Int Ed 2020, 59, 14481.

       下表是PROTAC與其他幾種藥物的特征對比，可以看出PROTAC在多個(gè)方面都比已有的三種藥物更加優(yōu)異。除此之外，PROTAC還有其他優(yōu)點(diǎn)：

       （1）用量小，催化劑量即可；

       （2）清除蛋白堆積；

       （3）**低；

       （4）不依賴(lài)于親和力，可選擇性高；

       （5）克服靶蛋白突變/過(guò)表達引起的耐藥等。

       表1. PROTAC藥物與其他幾種藥物的特征對比

       2 PROTAC存在的缺點(diǎn)和挑戰

       首先是三聯(lián)體成藥性差。傳統的PK、PD模型可能不適用于PROTAC技術(shù)，PROTAC的催化特性以及相對復雜的三聯(lián)體結構，可能使得組織分布不遵循傳統的pH分布理論，還有可能出現靶點(diǎn)介導的藥物處置現象導致PK/PD復雜化，但因目前相關(guān)的體內試驗較少，還沒(méi)有建立出針對PROTAC技術(shù)應用的的PK、PD模型。

       圖19. PROTAC三聯(lián)體成藥性差，圖源：http://new.qq.com/omn/20210322/20210322A0EICO00

       對于傳統的小分子藥物，可以用成藥性五原則對其進(jìn)行初步的判斷，但對于PROTAC來(lái)講這一規律已經(jīng)不能適用。PROTAC相當于是雙靶點(diǎn)藥物，分子量相對一般的小分子藥物較大，在700道爾頓以上，有的甚至超過(guò)1000道爾頓。這可能會(huì )影響到分子的水溶性及透膜性，不利于采用口服方式給藥的方式。目前常用的方式是經(jīng)腹膜內，皮下或靜脈內注射方式給藥。

       第三個(gè)缺點(diǎn)是三元復合體形成困難。PROTAC發(fā)揮藥效必須與目標靶蛋白和E3連接酶結合形成三元復合物。PROTAC分子太多或太少都不利于三元復合體的形成。成功形成三元復合體首先需要成功通過(guò)細胞膜進(jìn)入細胞，然后控制濃度以避免藥物分子與靶蛋白和E3連接酶分別形成二元復合物（hook effect，鉤效應），最后還要充分考慮靶蛋白與E3連接酶接觸區域的電荷排斥和立體結構排斥。

       圖20. PROTAC三元復合體形成困難，來(lái)源：http://new.qq.com/omn/20210322/20210322A0EICO00

       與設計和定制siRNA或RNA相比，PROTAC開(kāi)發(fā)周期相對較長(cháng)。如下圖所示，PROTAC不僅需要蛋白質(zhì)的配體，還需要蛋白質(zhì)轉化成PROTAC，這可能是一個(gè)耗時(shí)的過(guò)程，涉及大量的合成化學(xué)及藥物化學(xué)相關(guān)支持。基于標記的系統(HaloPROTACs和dTAG)雖然繞過(guò)了發(fā)現階段，但也同時(shí)廢除了PROTAC系統在可移植性（無(wú)需對其基因進(jìn)行修飾）方面的優(yōu)勢。

       圖21. PROTAC的開(kāi)發(fā)周期，來(lái)源：http://new.qq.com/omn/20210322/20210322A0EICO00

       除以上內容，PROTAC還存在一些其他缺點(diǎn)與挑戰：

       （1）Linker的選取問(wèn)題；

       （2）靶蛋白降解困難；

       （3）藥效性來(lái)源有待商榷；

       （4）可用的E3泛素連接酶數量有限；

       （5）PROTAC技術(shù)并非適用所有的蛋白質(zhì)或亞細胞位置等。

       04

       PROTAC的應用與前景

       先講講它的應用，前文講過(guò)了PROTAC從1995年到2015年的發(fā)展歷程，也是一步步的向著(zhù)成藥性在發(fā)展。尤其是在2013年，[kru：z]建立了Arvinas之后，它在2015年首次被帶入了藥物應用。而本部分的重點(diǎn)部分是AVS-110，AVS-378這兩個(gè)PROTAC分子。

       在2001年，[kru?z]等人合理地利用與泛素連接酶E3體系SCF結合的10肽，加上甲硫氨酰氨肽酶2的共價(jià)抑制劑，設計并合成了首 個(gè)用于降解MetAP2的PROTAC-1。蛋白試驗驗證了PROTAC-1可快速降解MetAP2，且它可以與那個(gè)共價(jià)抑制劑和10肽競爭性結合MetAP2和SCF。

       但是這個(gè)開(kāi)創(chuàng )性的工作并沒(méi)有就此結束，研究者提出了更進(jìn)一步的問(wèn)題。利用SCF的E3體系，是否可以設計不同的PROTAC用于降解其他致病蛋白？共價(jià)鍵蛋白抑制劑可以設計PROTAC，非共價(jià)鍵的天然底物能否用于設計PROTAC？PROTAC在蛋白水平試驗有效，在細胞內是否也能產(chǎn)生同樣的降解作用？

       帶著(zhù)這些問(wèn)題，他們選擇了與前列腺癌相關(guān)的雄激素受體（AR）和與乳腺癌相關(guān)的雌激素受體（ER）作為降解的目標蛋白。很有意思是，這兩個(gè)靶蛋白成為了后來(lái)Arvinas公司也是目前全球推進(jìn)最快的PROTAC降解的蛋白。這兩張圖就是將AR和ER泛素化的示意圖。

       圖22. AR和ER泛素化的示意圖，來(lái)源：Kathleen M. Sakamoto, Kyung B. Kim, Rati Verma, Andy Ransick, Bernd Stein, Craig M. Crews, Raymond J.Deshaies,Development of Protacs to Target Cancer-promoting Proteins for Ubiquitination and Degradation

       那么讓我們先來(lái)看一下做這兩種藥的重要性。以前列腺癌為例，為什么我們說(shuō)要給AR泛素化，去治療前列腺癌？

       那我們先來(lái)看看目前治療前列腺癌的方式：使用雄激素合成抑制劑阿比特龍和雄激素受體阻滯劑恩雜魯胺聯(lián)合治療，可以將疾病早期的未化療耐雄激素限制療法的前列腺癌患者中位總體生存期提高到53.6個(gè)月，另外提一下，被譽(yù)為癌癥治療新希望的免疫療法目前對耐雄激素限制療法的前列腺癌一點(diǎn)辦法也沒(méi)有，而且一般的前列腺癌都會(huì )演變成這種，患者平均中位生存時(shí)間僅12.3個(gè)月。但遺憾的是2012年獲FDA批準，到現在還沒(méi)有進(jìn)口。

       為了降解ER和AR，研究者分別利用了其天然底物雌二醇（E2）和二氫睪脂酮（DHT），通過(guò)中間的Linker連接IκBα磷酸化的10肽，設計了PROTAC-2和PROTAC-3。這次用來(lái)設計PROTAC的小分子為天然底物的激動(dòng)劑，而非抑制劑，這說(shuō)明設計PROTAC不一定非要選擇抑制劑，激動(dòng)劑也是可以的。

       接下來(lái)是前景部分。這里展示了8種常用E3連接酶以及超20個(gè)抗癌靶點(diǎn)，其前景不言而喻。只是目前來(lái)看，PROTAC雖然具有治療多種疾病的前景，但目前這類(lèi)藥物主要被調查用于治療癌癥。

       表2. 小分子PROTAC成功靶向的關(guān)鍵癌癥靶點(diǎn)，表格來(lái)源：Khan S, He Y, Zhang X, Yuan Y, Pu S, Kong Q, Zheng G, Zhou D. PROteolysis TArgeting Chimeras (PROTACs) as emerging anticancer therapeutics.

       PROTAC技術(shù)給我們的啟發(fā)就是，以后成藥不一定非要去找一個(gè)蛋白的抑制靶點(diǎn)，可以找這個(gè)蛋白隨意的一個(gè)靶點(diǎn)，只要足夠特異，不會(huì )引起off target**就行，然后把這個(gè)靶點(diǎn)的配體放在啞鈴的一端，就可以成藥。

       對于剛才講的XOR抑制也是如此，別嘌醇和非布司他都是XOR的抑制劑，可以只去找它的結合位點(diǎn)，不一定要抑制它，那就能做出一個(gè)幾乎沒(méi)有副作用的藥。

       關(guān)于筆者

       尋藥真理團

       他們是南京大學(xué)新藥研發(fā)策略課程的學(xué)生，本篇為該課程中嚴玉、朱菲、李曉煒、苗聲宇4位同學(xué)共同完成。

       他們朝氣蓬勃、他們斗志昂揚，他們腳踏實(shí)地學(xué)習新藥研發(fā)知識，他們堅信吾愛(ài)吾師吾更愛(ài)真理。

       他們是新一代醫藥行業(yè)接班人，他們是新藥研發(fā)領(lǐng)域的未來(lái)之光！

       參考文獻：

       [1] Sakamoto,K. M.; Kim, K. B.; Verma, R.; Ransick, A.;Stein, B.; Crews, C. M.;Deshaies, R. J., Development of Protacs to targetcancer-promotingproteins for ubiquitination and degradation. Mol CellProteomics 2003, 2 (12), 1350-8.

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