2021年10月26日，國家藥典委員會(huì )官網(wǎng)發(fā)布《細胞類(lèi)制品微生物檢查法》公示稿，公示期為三個(gè)月，彌補了國內細胞類(lèi)制品快速微生物替代方法領(lǐng)域的空白。
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0 1.
細胞類(lèi)制品微生物檢查方法創(chuàng )新的必要性
近年來(lái)，細胞類(lèi)制品（如明星產(chǎn)品-細胞治療產(chǎn)品）突飛猛進(jìn)的發(fā)展，因其在臨床研究中取得的顯著(zhù)療效而成為學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界共同關(guān)注的焦點(diǎn)，在腫瘤領(lǐng)域（白血病、淋巴瘤等）治療中展現出顯著(zhù)的治療效果而成為國內外研究的熱點(diǎn)。
但該類(lèi)制品在質(zhì)量屬性和無(wú)菌生產(chǎn)工藝上存在諸多特殊性，其個(gè)體差異大、產(chǎn)量少、效期短、臨床需求緊迫，終產(chǎn)品需要快速放行；加上作為無(wú)菌產(chǎn)品在生產(chǎn)過(guò)程中，因細胞本身無(wú)法過(guò)濾除菌，無(wú)菌生產(chǎn)工藝要求更高，對過(guò)程控制要求也更高，無(wú)菌檢查試驗仍按現行版《中國藥典》中的無(wú)菌試驗方法對細菌、真菌檢查，這將不利于細胞類(lèi)制品的研發(fā)和最終產(chǎn)品的無(wú)菌保證，中檢院、上海藥檢所等多名無(wú)菌檢測領(lǐng)域專(zhuān)家發(fā)文呼吁國內應參考《歐洲藥典》“細胞產(chǎn)品的微生物控制”（Microbiological Examinationof Cell-based Preparations），盡快制訂中國特色的無(wú)菌檢查方法。
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0 2.
2020年版《中國藥典》微生物檢查方法用于細胞類(lèi)制品局限性
現行版《中國藥典》（2020年版）傳統的無(wú)菌檢查方法存在局限性，表現在以下幾個(gè)方面：
(1) 檢測試驗時(shí)間長(cháng),效率低下，一個(gè)試驗周期至少需14天,不利于企業(yè)及早采取糾正措施,無(wú)法保證在產(chǎn)品使用前完成放行檢查。根據《細胞治療產(chǎn)品研究與評價(jià)技術(shù)指導原則（試行）》（20171222）當細胞治療產(chǎn)品放行檢驗受到時(shí)間限制時(shí)，可考慮加強工藝過(guò)程中的樣品質(zhì)量監控，將過(guò)程控制與放行檢驗相結合，通過(guò)過(guò)程控制簡(jiǎn)化放行檢驗。
(2) 一些微生物在指定試驗條件下不易生長(cháng)，即現行版《中國藥典》（2020年版）傳統的培養基配方和培養條件可能不適合一些微生物的生長(cháng)，據報道有超過(guò)30%無(wú)菌檢查失敗發(fā)生在第7-14天。
(3) 細胞類(lèi)制品樣品量少，使無(wú)菌檢查試驗檢測污染物的能力受到限制，污染程度越輕，出現錯誤結果的可能性越大。
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0 3.
中國特色的快速無(wú)菌檢查法規重點(diǎn)內容搶先看
《細胞類(lèi)制品微生物檢查法》為快速微生物檢查法，主要適用于效期短、批量小，采用現行無(wú)菌檢查法（通則1101）無(wú)法保證在產(chǎn)品使用前完成放行檢查的細胞類(lèi)制品。
采用本法進(jìn)行產(chǎn)品的微生物放行檢查，應在充分考慮制品生產(chǎn)工藝、無(wú)菌保障水平、微生物污染風(fēng)險、使用者獲益/風(fēng)險等因素的基礎上，經(jīng)風(fēng)險評估后有條件地施行。《細胞類(lèi)制品微生物檢查法》法系采用基于商品化全自動(dòng)微生物培養系統檢測方法，通過(guò)儀器實(shí)時(shí)監測微生物生長(cháng)代謝產(chǎn)生的二氧化碳引起的培養瓶?jì)确磻孜锏娘@色或熒光變化信號，或培養瓶頂空壓力變化信號，結合目視觀(guān)察，判定供試品中有無(wú)微生物生長(cháng)，重點(diǎn)內容梳理如下：
1、培養基適用性檢查
此部分概括了商品化的儀器適配的培養基適用性檢查的確認條件。至少應有2種適宜培養基用于檢測真菌、需氧細菌和厭氧細菌，包括無(wú)菌性檢查和靈敏度檢查。
1.1促生長(cháng)試驗用微生物
檢測真菌、需氧細菌和厭氧細菌的培養基應分別接種不大于100CFU的試驗菌，中國特色《細胞類(lèi)制品微生物檢查法》沒(méi)有列舉培養基適用性檢查用微生物的種類(lèi)，筆者摘錄了歐洲藥典，促生長(cháng)試驗用微生物示例，供國內研究者參考，示例如下圖：
1.2培養溫度
置于系統確認的培養溫度下培養，除另有規定外，接種細菌的培養基應在3天內生長(cháng)良好，接種真菌的培養基應在5天內生長(cháng)良好，中國特色《細胞類(lèi)制品微生物檢查法》沒(méi)有列舉合理溫度設定的參數，筆者摘錄了歐洲藥典，自動(dòng)化培養系統或自動(dòng)化和人工結合試驗法的合理溫度設定示例，供國內研究者參考，示例如下圖：
2、方法適用性試驗
應至少采用2個(gè)批次的供試品進(jìn)行方法適用性試驗，每批供試品應至少平行進(jìn)行3個(gè)重復的獨立實(shí)驗，方法適用性試驗示例如下表：
3、供試品的快速無(wú)菌檢查
3.1取樣
供試品應能代表細胞產(chǎn)品的所有組分，并從成品中取樣。如成品取樣不適用，可采用替代取樣方案，如選取在處理細胞最后接觸的液體中取樣。采用本法進(jìn)行生產(chǎn)過(guò)程的中間質(zhì)控時(shí)，應從相應質(zhì)控點(diǎn)取樣。
3.2供試品的最少檢驗量
對于單個(gè)容器且總體積（V）在1ml~1L的單一批次細胞制劑，供試品的最少檢驗量不應低于下表；中間產(chǎn)品有多個(gè)容器時(shí)，每個(gè)容器應分別取樣進(jìn)行檢測。取樣后應盡快將供試品接種至培養基，如供試品需存放，應評估存放的潛在污染風(fēng)險。
3.3培養及觀(guān)察
將供試品接種至培養基后盡快置于儀器中培養，禁止儲存。培養時(shí)間不少于7天，根據方法適用性試驗結果及特殊相關(guān)微生物的情況，可延長(cháng)至14天。
3.4結果判斷
(1) 若儀器判定各供試品管均為陰性結果，且目視觀(guān)察未見(jiàn)渾濁，則供試品可判為符合規定。
(2) 若儀器判定有供試品管為陽(yáng)性結果，且目視觀(guān)察發(fā)現渾濁，則供試品判為不符合規定。
(3) 若儀器判定供試品管為陰性結果，但目視觀(guān)察發(fā)現渾濁，或儀器判斷為陽(yáng)性結果，但目視觀(guān)察未發(fā)現渾濁，出現以上兩種情況時(shí)，取該培養物不少于1ml轉種至同種新鮮培養基中，將原始培養物和新接種的培養基繼續培養不少于4天，觀(guān)察接種的同種培養基是否再出現渾濁；或取培養液涂片,染色,鏡檢,判斷是否有菌。如目視觀(guān)察發(fā)現渾濁或涂片發(fā)現有菌生長(cháng)，判供試品不符合規定。
上述任何一種情況下如判供試品不符合規定，除非能充分證明試驗結果無(wú)效，即生長(cháng)的微生物非供試品所含，可對供試品進(jìn)行重試，重試時(shí)，應重新取同量供試品，依法檢查，結果判定同上。
應至少符合下列條件之一，判為試驗無(wú)效:
(1) 無(wú)菌檢查試驗所用的設備及環(huán)境的微生物監控結果不符合無(wú)菌檢查法的要求。
(2) 回顧無(wú)菌試驗過(guò)程，發(fā)現有可能引起微生物污染的因素。
(3) 在陰性對照中觀(guān)察到微生物生長(cháng)。
(4) 供試品管中生長(cháng)的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無(wú)菌試驗中所使用的物品和（或）無(wú)菌操作技術(shù)不當引起的。
專(zhuān)欄作者：滴水司南
生物醫藥高級工程師、執業(yè)藥師，自媒體時(shí)代的藥政法規搬運工，堅定終身學(xué)習的目標，堅持學(xué)用結合，努力做到知行合一。
參考文獻
[1] 中國藥典委員會(huì )官網(wǎng)、歐洲藥典、中國藥品標準雜志等
[2] www.gcpunion.org
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