8月23日，國家藥監局發(fā)布了關(guān)于黃連上清丸等水丸中水稻源性成分檢查項補充檢驗方法等2項補充檢驗方法的公告（2021年第101號）。
公告內容顯示：根據《中華人民共和國藥品管理法》及其實(shí)施條例的有關(guān)規定，《黃連上清丸（水丸）、龍膽瀉肝丸（水丸）、防風(fēng)通圣丸（水丸）和風(fēng)寒咳嗽丸（水丸）中水稻源性成分檢查項補充檢驗方法》《龍膽瀉肝丸中馬兜鈴酸I成分檢查項補充檢驗方法》經(jīng)國家藥品監督管理局批準，現予發(fā)布。
附：檢查項補充檢驗方法
【檢查】水稻源性成分
樣品制備供試樣品制備 取供試品適量，粉碎，稱(chēng)取10 g，加入65℃預熱的TE緩沖溶液（pH 8.0）（10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA）50ml，65℃水浴振搖至完全分散，立即吸取0.5ml混懸液至2ml離心管中，即得。
標準物質(zhì)樣品制備取水稻源性DNA檢測標準物質(zhì)1支，加無(wú)菌超純水100μl溶解，即得。
空白對照樣品制備取0.5ml的無(wú)菌TE緩沖溶液至2 ml離心管中，即得。
模板DNA提取取上述樣品，分別選用植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）提取，得模板DNA溶液，儲存于-20℃備用。
PCR反應鑒別引物：5' TTAGCCTCCCGCTGCAGA3'和5' AGAGTCCACAAGTGCTCCCG3'。PCR反應體系：在200μl離心管中進(jìn)行，反應總體積為25μl，反應體系包含2×PCR預混液（包含DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應緩沖液等）12.5μl，鑒別引物（50μmol/L）各0.2μl，模板DNA（或水稻源性DNA檢測標準物質(zhì)）溶液2μl，無(wú)菌超純水10.1μl。每個(gè)樣品設置2個(gè)平行。PCR反應參數：95℃預變性3分鐘，循環(huán)反應40次（95℃30秒，62℃30秒，72℃30秒），72℃延伸10分鐘，4℃保存反應產(chǎn)物。
電泳檢測照瓊脂糖凝膠電泳法（《中國藥典》2020年版通則0541），膠濃度為2.0%，膠中加入核酸凝膠染色劑GelRed；供試品、水稻源性DNA檢測標準物質(zhì)和空白對照溶液的上樣量分別為10-20μl，DNA分子量標記物（建議使用DL500）上樣量為5μl。電泳結束后，取凝膠片在凝膠成像儀上檢視。
系統適用性（1）空白對照在凝膠電泳圖譜中應無(wú)條帶檢出；（2）水稻源性DNA檢測標準物質(zhì)在凝膠電泳圖譜50~100bp中應有條帶檢出。應同時(shí)滿(mǎn)足以上2個(gè)條件，否則實(shí)驗無(wú)效。
克隆測序使用商業(yè)化PCR產(chǎn)物克隆試劑盒，將PCR特征條帶克隆到T載體上，用Sanger法進(jìn)行序列測定，與水稻參考序列進(jìn)行比對分析。
結果判定凝膠電泳圖譜中，供試品在50~100bp間不得出現與水稻源性DNA檢測標準物質(zhì)大小一致的條帶。若出現相應的條帶，其克隆測序結果與給定水稻參考序列應不一致。若出現個(gè)別堿基差異，將克隆測序結果與NCBI數據庫中其他水稻序列進(jìn)行比對，不應100%匹配。
水稻參考序列
AGAGTCCACAAGTGCTCCCGCGCGTCC GAAGAAACCAACCACACTGCCGCTCTGCAGCGGGAGGCTAA。
備注本方法所用容器應為一次性耗材或經(jīng)過(guò)徹底清洗和高壓消毒并消除核酸污染的耗材，否則不可重復使用。試劑均為分析純或生化試劑，實(shí)驗用水應符合GB/T6682的要求。所有試劑均用無(wú)DNA酶污染的容器盛裝。
起草單位：中國食品藥品檢定研究院
復核單位：四川省食品藥品檢驗研究院
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