前言

       1995年，美國兩個(gè)獨立的研究團隊同時(shí)發(fā)現了一個(gè)新型核受體，能夠微弱的被甲戊二羧酸途徑的中間體法尼醇所激活，因而取名為“法尼醇受體(FarnesoidX receptor，簡(jiǎn)稱(chēng)FXR)”。后續的研究發(fā)現，法尼醇受體在肝 臟、膽囊、腸道以及腎 臟中高度表達，而且確認了鵝去氧膽酸(CDCA)才是其真正的內源性配體，隨后，法尼醇受體的信號通路逐漸被揭示出來(lái)，并證明了其在肝 臟代謝調節中的重要作用。

       圖一 法尼醇受體信號通路

       在肝 臟中，FXR主要調控膽汁酸的合成、轉運以及糖、脂代謝相關(guān)基因的表達。對膽汁酸的調節作用主要表現在：腸道中被重吸收后的膽汁酸激活FXR，引起膽汁酸結合蛋白以及FGF19(纖維母細胞生長(cháng)因子)表達水平的升高，FGF19分泌進(jìn)入門(mén)靜脈循環(huán)，隨后在肝 臟中與FGFR4受體結合，活化MAPK信號通路，進(jìn)而引起CYP7A1(膽固醇7α羥化酶，是中性膽汁酸生物合成中的關(guān)鍵限速酶)表達的下調，以及通過(guò)誘導SHP(小異源二聚體伴侶分子)下調CYP7A1的表達，通過(guò)這兩條途徑，活化FXR可減少膽汁酸的合成。同時(shí)，FXR還可以調節膽汁酸解毒相關(guān)酶的表達，從而促進(jìn)膽汁酸的泌出，抑制膽汁酸的合成和肝細胞對其的再吸收。另外，活化FXR還能抑制脂肪再生酶系的關(guān)鍵轉錄因子(SREBP-1c)的活性，進(jìn)而達到調控甘油三酯代謝以及脂肪再生的作用。

       基于上述的研究結論，FXR是一個(gè)潛在的肝病和脂肪代謝作用靶點(diǎn)，如膽汁淤積相關(guān)疾病和非酒精性脂肪肝炎(NASH)。膽汁淤積相關(guān)肝病是由膽汁淤積造成的肝損傷，此類(lèi)疾病發(fā)病率較低，NASH是非常常見(jiàn)的一種慢性肝病，發(fā)病率較高，很容易誘發(fā)肝硬化以及肝癌，而且目前沒(méi)有針對該病的特 效藥，患者只能通過(guò)飲食控制、減肥來(lái)緩解病癥。

       圖二 FXR激動(dòng)劑

       鑒于FXR顯著(zhù)的生理調節作用，很多制藥巨頭參與到了FXR激動(dòng)劑的開(kāi)發(fā)中，如禮來(lái)、GSK、諾華等。奧貝膽酸是第一個(gè)上市的FXR激動(dòng)劑，由美國Intercept公司開(kāi)發(fā)，屬于膽汁酸類(lèi)似物，于2016年5月31日獲得FDA批準上市，適應癥為原發(fā)性膽汁性膽管炎。另外，針對NASH適應癥的臨床研究目前已推進(jìn)至三期。奧貝膽酸的上市證明了FXR在肝病領(lǐng)域的巨大潛力，然而該藥并不理想，瘙癢反應明顯，個(gè)別患者還出現了較為嚴重的心血管事件，除此之外，還會(huì )導致血脂指標的紊亂以及心血管疾病的風(fēng)險提高，如動(dòng)脈粥樣硬化等，如此大大限制了奧貝膽酸的臨床應用，因此開(kāi)發(fā)具有選擇性的FXR激動(dòng)劑，就成了目前最 具前景的方向。

       圖三 異惡唑類(lèi)非甾體FXR激動(dòng)劑

       2000年，GSK通過(guò)對樣本為9000的化合物庫進(jìn)行篩選，通過(guò)非細胞-結合敏感性測試，得到非膽汁酸異噁唑類(lèi)FXR激動(dòng)劑GW4064。該化合物體外測試表現優(yōu)異，然而PK數據太差(高清除率和低生物利用度)以及潛在的**和光不穩定性，主要是結構中的二苯乙烯結構造成的，大大限制了其成藥的可能性，因此，對二苯乙烯結構的優(yōu)化就成為了第一個(gè)突破方向。

       圖四 GW4064的初步優(yōu)化

       二苯乙烯結構的構象剛性是實(shí)現激動(dòng)作用的關(guān)鍵。它在溶液中僅存在兩種主要的構象，如果還原掉雙鍵后，自由度大大增加，會(huì )降低其對FXR受體的轉錄激動(dòng)作用，因此在對二苯乙烯結構進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，要充分保證其構象剛性，因為如果分子的構象數目眾多，就會(huì )導致分子難于以正確的構象與靶分子結合，引起分子-靶點(diǎn)親和力的下降，對于可旋轉鍵數目在五個(gè)或者五個(gè)以上的化合物，其晶體結構并不能代表其與蛋白結合的真實(shí)構象，此外，同一個(gè)藥物的不同構象可能會(huì )與不同的靶點(diǎn)分子相結合，導致選擇性降低，引起**和不良反應。對分子進(jìn)行構象限制的方式有很多種，如柔性鍵可通過(guò)成環(huán)固定，柔性鏈可以通過(guò)引入雙鍵、三鍵、酰胺、芳環(huán)等剛性官能團進(jìn)行構象限制，還可以通過(guò)立體位阻方式進(jìn)行構象限制。

       為了簡(jiǎn)化合成難度，四個(gè)去氯含萘化合物A-D被制備出來(lái)，其中A、B分別模擬了GW4064在溶液中的兩種構象，C、D則是為了探究GW4064中的羧基取代位置是否為最優(yōu)位置。從上述數據可以看出，剛性保持的設計思路是合理的，A為全激動(dòng)劑且活性和GW4064相近。A、B、C、D四個(gè)化合物中，A(GSK8062)的活性最好，證明了GW4064中羧基的取向是合理的。

       GSK8062在體外測試中表現良好，活性與GW4064相近，但光穩定性大大提高，在狗和猴子的實(shí)驗中，口服生物利用度良好，耐受性在可接受的范圍，該化合物存在的主要問(wèn)題是中性溶液中溶解性差，其次，在大鼠的實(shí)驗中，口服暴露量有限，主要是高的清除率造成。再次，該化合物很難制備得到一個(gè)合適的結晶鹽，后續的優(yōu)化除進(jìn)一步提高效能外，還需要解決溶解性以及成鹽性問(wèn)題。

       圖五 萘環(huán)雜環(huán)化

       針對上述問(wèn)題，將萘環(huán)氮雜化是一個(gè)理想的優(yōu)化策略。如圖五所示，將GSK8062的萘環(huán)進(jìn)行不同位置的氮雜設計，其中化合物A1和化合物A4表現出和GSK8062相近的活性，A1為全激動(dòng)劑，而A4為部分激動(dòng)劑，細胞測試顯示兩者的活性相近(A1，EC50=50 nm；A4，EC50=77 nm)，在比格犬、大鼠、小鼠、食蟹猴四種動(dòng)物上進(jìn)行的試驗顯示，化合物A1表現出更好的生物利用度和更高的口服給藥后曲線(xiàn)下面積(AUC)，因此，選擇化合物A1作為階段性的優(yōu)化成果，進(jìn)行更進(jìn)一步的優(yōu)化(GSK2324)。

       圖六 羧基部分的雜環(huán)化取代

       雖然相比GSK8062，GSK2324的PK有了很大的改善，但是活性并未得到多少提高，從配體-受體蛋白共結晶X光衍射分析，羧酸部分與受體蛋白結合的調整仍然具有較大的優(yōu)化空間，因此，將GSK2324中萘環(huán)部分采用一系列含羧基雜環(huán)取代，以期實(shí)現更好的活性(圖六)。化合物B3和化合物B4的活性相比GSK2324提高了四倍多，比較有意思的是化合物B4和化合物B11相比，結構上僅僅是羧基取代位置的差異，而活性卻相差30倍之多，且B4為全激動(dòng)劑，而B(niǎo)11僅為部分激動(dòng)劑，由于種種原因，GSK中斷了此系列化合物的進(jìn)一步研發(fā)，不過(guò)這些發(fā)現，為后續異惡唑類(lèi)FXR激動(dòng)劑的研發(fā)提供了寶貴的經(jīng)驗。

       圖七 EliLilly異惡唑類(lèi)FXR抑制劑

       Eli Lilly在GW4064以及其他相關(guān)研究的基礎上，開(kāi)發(fā)出了含哌 啶環(huán)的異惡唑類(lèi)FXR激動(dòng)劑LY2562175，相比GW4064，其體外活性提高了一倍，但是效能僅有40%，為部分激動(dòng)劑，它的結構與上述提及的化合物B4有很大的相似性，唯一比較大的差別是中間的苯環(huán)被哌 啶環(huán)取代，導致分子的構象自由度增加，效能降低也在預料之中。至于為什么Eli Lilly沒(méi)有繼續保留SP2連接鍵，并未見(jiàn)相關(guān)報道，但可以推測，應該是為了提高成藥性而做出的優(yōu)化。

       圖八 Novartis苯并噻吩全激動(dòng)劑

       Novartis在進(jìn)行此類(lèi)FXR激動(dòng)的優(yōu)化時(shí)，保留了LY2562175中的哌 啶環(huán)，將先前的甲基吲哚替換為苯并噻吩，得到一個(gè)全激動(dòng)劑C1(圖七)，其活性相比GW4064提高了一倍多，而且也解決了LY2562175部分激動(dòng)的問(wèn)題，但是C1的血漿清除率較高且口服生物利用率極低(6%)，在肝微粒體的代謝研究中，發(fā)現2,6-二氯苯是導致上述問(wèn)題的關(guān)鍵，主要是因為該部分結構優(yōu)良親脂性，通常親脂性?xún)?yōu)異的化合物更容易與體內的代謝酶系發(fā)生作用，引起嚴重的首過(guò)效應。

       圖九 2,6-二氯苯優(yōu)化

       在親脂性和代謝穩定優(yōu)化中，氟取代是常用的方式，保留C1中的苯并噻吩結構，將2,6-二氯苯的氯原子進(jìn)行氟取代，得到的三個(gè)化合物(圖八)中，C2和C3活性降低比較明顯，且代謝穩定性并未得到明顯的提高。C4活性降低了約一倍，但代謝穩定性得到了相當明顯的改善，口服生物利用度37%，血漿清除率24mL/min/kg。

       圖十 活性?xún)?yōu)化

       在改善代謝穩定性后，C4相對于GW4064活性相似，將哌 啶環(huán)部分用氮雜吖丁環(huán)或吡咯環(huán)取代后，導致活性明顯降低，而消旋的八元氮雜環(huán)取代(C6)活性雖然得到了提高，但代謝穩定性較差，不利于成藥。采用莨菪烷取代后(C7)，發(fā)現活性極大的提高，可能是因為莨菪烷的橋環(huán)結構能夠最大限度的保持分子的構象剛性，這也是先前眾多藥物化學(xué)家在進(jìn)行此類(lèi)化合物優(yōu)化時(shí)采用的策略。后續的核受體選擇性測試和PK試驗中，C7表現優(yōu)異，是一個(gè)非常理想的異惡唑類(lèi)FXR激動(dòng)劑備選藥物。

       目前化合物C7(LJN452)已推進(jìn)至臨床二期研究，主要針對膽汁淤積性肝病和非酒精性脂肪肝。2016年，Novartis發(fā)布了LJN452的首次臨床數據，結果喜人，總共有95名受試者參加了這項研究，接受至少一次劑量的LJN452或匹配的安慰劑，其藥代動(dòng)力學(xué)適合每日一次給藥，劑量依賴(lài)的藥效關(guān)系顯著(zhù)！在健康受試者中，LJN452在高達3mg的單劑量下安全性和耐受性表現良好，未觀(guān)察到藥物相關(guān)的不良反應，多次給藥后未發(fā)現藥物引起的相關(guān)瘙癢反應出現，個(gè)別受試者出現ALT(谷丙轉氨酶)/AST(谷草轉氨酶)的升高，但并不造成臨床后遺癥，從目前一期臨床數據來(lái)看，表現還不錯，但是具體的情況還要等到后續二期臨床的數據，LJN452能否脫穎而出成為下一個(gè)FXR激動(dòng)劑，還需要用事實(shí)說(shuō)話(huà)！

       總結

       本文簡(jiǎn)要介紹了FXR激動(dòng)劑LJN452的開(kāi)發(fā)歷程，以及分子構象剛性設計策略在其開(kāi)發(fā)中的應用，從最初的先導化合物GW4064到后來(lái)的備選藥物L(fēng)JN452，可謂是一路波折，其中所傳遞出的設計思路，值得我們學(xué)習，同時(shí)也希望LJN452在后續的臨床試驗中順利，畢竟肝 臟相關(guān)疾病的可用藥物確實(shí)相對較少，尤其是非酒精性脂肪肝病！

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       參考資料

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