1. 甲基化研究的意外發(fā)現(xiàn)

       像弗萊明偶然發(fā)現(xiàn)了青霉素一樣，RNA激活現(xiàn)象也是偶然中發(fā)現(xiàn)的。那時(shí)，李龍承博士正在加州大學(xué)舊金山分校（UCSF）從事腫瘤DNA甲基化的研究。在腫瘤細(xì)胞中，許多抑癌基因因?yàn)閱?dòng)子區(qū)發(fā)生高度甲基化而失活，導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生，這在當(dāng)時(shí)是很熱門(mén)的研究領(lǐng)域。在研究了大量的抑癌基因后，一個(gè)現(xiàn)象讓李博士很是不解，就是同一個(gè)抑癌基因在有的腫瘤中存在甲基化失活，而有的腫瘤沒(méi)有；而在同一種腫瘤中，有的抑癌基因被甲基化沉默了，有的又沒(méi)有。到底是什么信號(hào)決定了哪些基因被甲基化和基因的哪些位置發(fā)生甲基化呢？

       2004年，李博士注意到植物細(xì)胞中存在一種雙鏈RNA（dsRNA）通過(guò)Argonaute蛋白途徑介導(dǎo)DNA甲基化（RDDM，RNA DirectedDNA methylation）的現(xiàn)象。受這一現(xiàn)象的啟發(fā)，李博士開(kāi)始研究人類細(xì)胞中是否存在相同的機(jī)制。為此，李博士設(shè)計(jì)了兩條針對(duì)鈣粘素E基因啟動(dòng)子區(qū)的dsRNA，希望這兩條dsRNA能夠作為一種信號(hào)分子，指導(dǎo)細(xì)胞對(duì)靶點(diǎn)區(qū)域的DNA進(jìn)行甲基化，進(jìn)而下調(diào)鈣粘素E基因的表達(dá)。然而，意外發(fā)生了。鈣粘素E基因的表達(dá)不僅沒(méi)有下調(diào)，反而提高了很多。剛開(kāi)始李博士也以為是實(shí)驗(yàn)操作中出錯(cuò)了，但是后續(xù)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)仍舊是相同的結(jié)果，使得他們初步確認(rèn)一個(gè)新的基因調(diào)控機(jī)制被發(fā)現(xiàn)了。之后李博士的實(shí)驗(yàn)室在多個(gè)基因上都發(fā)現(xiàn)了同樣的dsRNA激活基因表達(dá)的現(xiàn)象，最終于2006年確認(rèn)了這是獨(dú)立于RNAi的一種小RNA指導(dǎo)的基因調(diào)控方式---RNA激活（RNA activation，簡(jiǎn)稱RNAa）。

       熟悉核酸技術(shù)發(fā)展史的人們應(yīng)該記得，2006年，當(dāng)時(shí)在華盛頓卡內(nèi)基研究所的Andrew Fire和馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Craig Mello因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)RNAi機(jī)制而分享了當(dāng)年的諾貝爾獎(jiǎng)?？赡苁且?yàn)镽NAi技術(shù)風(fēng)頭正健，也可能是因?yàn)檫@種現(xiàn)象太不可思議，有關(guān)RNAa現(xiàn)象文章的發(fā)表并不順利。歷經(jīng)Science和Nature多次修稿和拒稿之后，終于在RNAi技術(shù)獲得諾獎(jiǎng)的同一年發(fā)表于美國(guó)科學(xué)院院刊（PNAS）。有趣的是，RNAa現(xiàn)象是首先在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，時(shí)隔七年之后的2013年，Craig Mello實(shí)驗(yàn)室和其他幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室在線蟲(chóng)中也觀察到了RNAa現(xiàn)象的存在，證明了RNAa在物種之間的保守性。眾所周知，很多基礎(chǔ)的生物學(xué)現(xiàn)象都是在低等的模式動(dòng)物如線蟲(chóng)、斑馬魚(yú)等中發(fā)現(xiàn)的，然后在高等動(dòng)物中得到驗(yàn)證。而RNAa的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證整好是相反的過(guò)程，這就說(shuō)明科學(xué)研究的路徑不是一成不變的。當(dāng)有新的現(xiàn)象被揭示時(shí)，要有坦然接受的能力。
 

       2. RNAa作用機(jī)制

       時(shí)至今日，關(guān)于RNAa的研究越來(lái)越多，它的神秘面紗逐步被揭開(kāi)。當(dāng)dsRNA（被稱為saRNA，小激活RNA）裝載到Argonaute2（Ago2）蛋白后，其中的一條鏈（通常被稱為“過(guò)客鏈”，另一條鏈被稱為“引導(dǎo)鏈”）被Ago2從中間切斷并從Ago2復(fù)合體中脫落。之后Ago2復(fù)合體通過(guò)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞核，其與RNA helicase A （RNA解旋酶A，RHA）相互作用形成Ago2-RHA復(fù)合體，復(fù)合體開(kāi)始在染色體上尋找與引導(dǎo)鏈互補(bǔ)的基因序列。一旦找到互補(bǔ)的基因序列并與之結(jié)合，Ago-2-RHA復(fù)合體招募polymerase-associated factor 1（聚合酶相關(guān)因子1，PAF1）形成RITA（RNA-induced transcriptional activation，RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活）復(fù)合體，該復(fù)合體進(jìn)一步招募和激活RNA polymerase II（RNA聚合酶II），導(dǎo)致mRNA表達(dá)的增加。具體的通路如下圖所示。

圖1 RNAa作用機(jī)制 （來(lái)自參考資料1）
 

       3. RNAa應(yīng)用，大有可為

       人類基因組計(jì)劃（human genome project，HGP）完成后，后基因組時(shí)代已然來(lái)臨。發(fā)現(xiàn)新基因、鑒定基因功能以及基因之間相互關(guān)系是后基因組時(shí)代的重要課題。由于saRNA誘導(dǎo)的基因激活具有高特異性、高效性和方便性，因此作為一種遺傳學(xué)技術(shù)應(yīng)用于基因功能研究，對(duì)于研究基因的致病機(jī)理、藥物作用機(jī)制等具有重要意義。

       而RNAa作為一種稀缺的能夠做“加法”的技術(shù)，我們預(yù)計(jì)其在疾病治療領(lǐng)域，會(huì)有更廣闊的天地。表1根據(jù)美國(guó)FDA批準(zhǔn)的藥物統(tǒng)計(jì)了目前所有成藥的靶點(diǎn)，包括小分子藥物靶點(diǎn)749個(gè)，生物制品靶點(diǎn)179個(gè)；其中蛋白型靶點(diǎn)856個(gè)，非蛋白型靶點(diǎn)37個(gè)。蛋白質(zhì)之所以成為藥物靶點(diǎn)的主要類型，是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的三維結(jié)構(gòu)提供了藥物結(jié)合的位點(diǎn)。這也是目前小分子和抗體藥物面臨的困境，他們的繼續(xù)開(kāi)發(fā)依賴于蛋白結(jié)構(gòu)的深入研究并且受到蛋白自身結(jié)構(gòu)的限制。而核酸藥物則不受這種限制。人類的39000多個(gè)基因，都有可以成為核酸藥物的靶點(diǎn)。正是得益于這種優(yōu)勢(shì)，RNAa療法幾乎可以應(yīng)用于我們能夠想到的任何疾病領(lǐng)域。例如，在腫瘤領(lǐng)域，可以通過(guò)激活抑癌基因?qū)崿F(xiàn)治療腫瘤的目的；在心血管領(lǐng)域，可通過(guò)激活VEGF治療缺血性疾?。粚?duì)于感染性疾病，有人嘗試用RNAa機(jī)制激活潛伏的HIV-1病毒來(lái)達(dá)到根除病毒感染的目的。

       實(shí)際上，RNAa療法在單基因遺傳病方面，尤其是單等位突變導(dǎo)致的基因表達(dá)不足而引發(fā)的罕見(jiàn)病方面有其特別的優(yōu)勢(shì)。對(duì)于這類蛋白功能缺失性疾病，雖然基因治療已經(jīng)成藥，但開(kāi)發(fā)難度極大且有潛在的較為嚴(yán)重的副作用。作為一種簡(jiǎn)便的靶向基因開(kāi)啟技術(shù)，RNAa療法有可能在罕見(jiàn)病領(lǐng)域大放異彩。

       表1 FDA批準(zhǔn)藥物對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)數(shù)目匯總

來(lái)自參考資料2
 

       4. RNAa可能面臨與RNAi不同的成藥挑戰(zhàn)

       目前，已經(jīng)有兩款siRNA藥物上市，而作為與siRNA結(jié)構(gòu)類似、功能相反的saRNA進(jìn)展最快的仍處于二期臨床階段。與siRNA相比，saRNA發(fā)揮作用還需要穿透核膜，這樣看來(lái)saRNA似乎比siRNA的遞送更具有挑戰(zhàn)性。目前我們已知saRNA從胞質(zhì)到胞核是一個(gè)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程，也就是說(shuō)saRNA只要能跨膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，剩下的入核過(guò)程可以交給細(xì)胞內(nèi)源的機(jī)制去完成。而與siRNA作用于mRNA相比，saRNA的靶點(diǎn)是DNA，其在每個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)（2個(gè)）明顯低于mRNA（幾百上千），加上saRNA對(duì)表觀遺傳產(chǎn)生影響，具有長(zhǎng)效性，所以實(shí)際上在核內(nèi)發(fā)揮作用的saRNA劑量可大大低于siRNA。即便是考慮細(xì)胞核對(duì)雙鏈核酸的外排作用，我們?nèi)匀豢梢酝茰y(cè)saRNA發(fā)揮作用并不會(huì)面臨比siRNA更大的障礙。當(dāng)然最終的結(jié)論還是需要更多的實(shí)驗(yàn)，甚至臨床結(jié)果去驗(yàn)證。
 

       5. UCSF的專利輾轉(zhuǎn)

       早在2005年9月，加州大學(xué)就遞交了關(guān)于RNAa作用機(jī)理的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)，期望獲得RNAa的機(jī)制保護(hù)及saRNA在基因激活應(yīng)用方面的保護(hù)。2008年，RNAi領(lǐng)域的領(lǐng)頭羊公司Alnylam取得了該技術(shù)的許可使用權(quán)，開(kāi)始進(jìn)行saRNA藥物研究，這是RNAa療法最早的商業(yè)開(kāi)發(fā)。遺憾的是，siRNA藥物開(kāi)發(fā)初期由于遞送和免疫反應(yīng)的問(wèn)題屢遭挫折，跨國(guó)藥企紛紛離場(chǎng)，導(dǎo)致Alnylam自己都艱難度日。最終Alnylam還是決定聚焦于siRNA，暫時(shí)放棄saRNA藥物開(kāi)發(fā)，saRNA技術(shù)的許可使用權(quán)也于2012年被加州大學(xué)收回。

       Dr. Nagy是英國(guó)MiNA公司的創(chuàng)始人，本身也是一位多產(chǎn)的發(fā)明家，擁有很多外科器械方面的發(fā)明，同時(shí)在基因治療、干細(xì)胞治療、內(nèi)窺鏡檢查和外科手術(shù)方面發(fā)表了廣泛的著作。2012年的美國(guó)小核酸治療協(xié)會(huì)年會(huì)上，Nagy聽(tīng)到了李龍承博士關(guān)于RNAa技術(shù)的報(bào)告，馬上意識(shí)到這是一個(gè)很有開(kāi)發(fā)前景的技術(shù)。Nagy迅速與加州大學(xué)聯(lián)系，在2014年取得RNAa技術(shù)的許可使用權(quán)，并于2016年開(kāi)始進(jìn)行全球第一款saRNA藥物的臨床研究。光一樣的速度！

       作為RNAa技術(shù)的開(kāi)拓者，李龍承博士很早就意識(shí)到其在制藥領(lǐng)域的無(wú)限潛力。2008年，舊金山灣區(qū)著名的生物醫(yī)藥風(fēng)險(xiǎn)投資公司Alta Partners計(jì)劃支持李博士成立初創(chuàng)公司開(kāi)發(fā)RNAa技術(shù)。因?yàn)楫?dāng)時(shí)加州大學(xué)已經(jīng)決定將該技術(shù)授權(quán)給Alnylam，這一計(jì)劃最終夭折。2015年，加州大學(xué)專利獲得授權(quán)，他們最初設(shè)計(jì)的RNAa機(jī)理的保護(hù)并沒(méi)有得到支持，獲得保護(hù)的只是有限的靶點(diǎn)和具體的saRNA序列。這對(duì)于其他靶點(diǎn)和序列的開(kāi)發(fā)并沒(méi)有限制作用。李龍承博士終于可以自由開(kāi)發(fā)由他自己開(kāi)創(chuàng)的技術(shù)，中美瑞康公司（Ractigen）應(yīng)運(yùn)而生。接下來(lái)我們擬對(duì)全球唯二的RNAa療法公司---英國(guó)MiNA和中國(guó)Ractigen進(jìn)行解讀。
 

       參考資料

       1. Treating disease at the RNA level witholigonucleotides, Arthur A. Levin, N Engl J Med, 2019;380:57-70

       2. A comprehensive map of molecular drug targets,Rita Santos, et al, Nat Rev Drug Discov. 2017;16(1):19-34