前不久，筆者介紹過(guò)生物技術(shù)藥物5大類(lèi)別的特點(diǎn)及其市場(chǎng)和代表藥物情況。在細述上述內容的基礎上，本稿件將從技術(shù)角度來(lái)聊一聊，生物技術(shù)藥物的藥學(xué)研究都有哪些內容。PS：大多數生物技術(shù)藥的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，其藥學(xué)研究有不同于化學(xué)藥物的特殊性，下面將以蛋白質(zhì)藥物為例來(lái)進(jìn)行說(shuō)明。

       01  穩定性~影響蛋白質(zhì)類(lèi)藥物的重要屬性之一！

       相對而言，蛋白質(zhì)類(lèi)藥物的穩定性不如化學(xué)藥物，其不穩定性可簡(jiǎn)單分為兩種：化學(xué)不穩定和物理不穩定。

       化學(xué)不穩定

       主要指蛋白質(zhì)分子通過(guò)共價(jià)鍵的形成和斷裂形成新的化學(xué)實(shí)體，包括水解、氧化、外消旋、β消旋和二硫鍵的交換。一般肽鍵在生理條件下相當穩定，但可被酸、堿或蛋白酶催化水解，使蛋白質(zhì)分子斷裂，分子量減少。蛋白質(zhì)中一些氨基酸可以發(fā)生自氧化，在氧化劑存在下，蛋白質(zhì)中的某些氨基酸側鏈很容易被氧化，使蛋白質(zhì)失活。含有芳香側鏈的氨基酸如甲硫氨酸、半胱氨酸、組氨酸、色氨酸和酪氨酸的蛋白質(zhì)易發(fā)生氧化反應（影響氧化的因素有溫度、pH、緩沖介質(zhì)、催化劑的種類(lèi)和氧的強度等）。蛋白質(zhì)在堿水解中常伴有某些氨基酸的消旋化作用，使氨基酸成為非代謝形式，從而改變蛋白質(zhì)的生物活性（影響氨基酸消旋作用的因素有溫度、pH、離子強度和金屬離子螯合作用）。二硫鍵對穩定蛋白質(zhì)的構象起重要作用，加熱可引起二硫鍵的斷裂或交換，導致蛋白質(zhì)的生物活性快速喪失。

       物理不穩定

       指蛋白質(zhì)分子的高級結構的物理轉變，無(wú)共價(jià)鍵改變，包括變性、表面吸附、聚集和沉淀。蛋白質(zhì)中非共價(jià)鍵的破壞可導致蛋白質(zhì)變性。在某些物理、化學(xué)的條件下，蛋白質(zhì)分子的高級結構受到破壞（但一級結構未被破壞），結果引起蛋白質(zhì)生物活性的損失和理化性能的改變，這就是蛋白質(zhì)的變性。影響蛋白質(zhì)變性的因素有：溫度、pH、鹽類(lèi)、有機溶劑、表面活性劑、機械應力、超聲波、光照等。

       表面吸附可導致蛋白質(zhì)構象的變化，使蛋白質(zhì)分子變性，活性喪失。同時(shí)由于蛋白質(zhì)多肽類(lèi)藥物有效劑量小，吸附作用使制劑中藥物含量顯著(zhù)降低，療效降低。使用表面活性劑、加入載體蛋白如血清白蛋白可減少其表面吸附。蛋白質(zhì)溶液是一種穩定親水膠體，但在外界因素（pH、溶劑、離子強度、溶劑介電常數）的影響下發(fā)生自締合形成二聚體、低聚物等。在外界因素影響下，蛋白質(zhì)分子結構發(fā)生伸展，疏水區暴露于水性環(huán)境，形成熱力學(xué)不穩定體系，驅使暴露的疏水區分子間相互聚集形成聚集體。蛋白質(zhì)沉淀通常與變性同時(shí)發(fā)生。蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽、重金屬、有機溶劑或者加熱均可導致蛋白質(zhì)的沉淀。

       02  蛋白質(zhì)類(lèi)藥物相關(guān)給藥系統

       現如今，小分子藥物已形成多種給藥方式，但對于大分子生物制劑，通常仍以注射給藥為主，但近年來(lái)口服給藥等小分子藥物常用劑型已逐漸成為開(kāi)發(fā)大分子藥物的亮點(diǎn)。

       蛋白質(zhì)類(lèi)藥物給藥途徑

       注射給藥

       蛋白質(zhì)、多肽類(lèi)藥物由于口服吸收的限制，臨床多采用注射途徑給藥，包括靜脈注射、肌內注射、皮下注射、腹腔注射。但蛋白質(zhì)、多肽類(lèi)藥物一般體內血漿半衰期較短，清除率高，須頻繁注射給藥。

       延長(cháng)蛋白多肽類(lèi)藥物體內半衰期最簡(jiǎn)單的方法是靜脈注射給藥改為肌內注射或皮下注射。采取此法時(shí)應注意隨之引起的蛋白質(zhì)降解和體內的變化。另一種方法是采取新的給藥系統延緩藥物的釋放，如輸入泵、生物降解性微球、微乳、復乳、脂質(zhì)體、納米粒和聚合物結合物。此外，對蛋白質(zhì)分子進(jìn)行化學(xué)修飾以抑制其清除，目前最常用的是聚乙二醇修飾。

       口服給藥

       蛋白質(zhì)類(lèi)藥物的口服給藥存在以下限制，1）被胃酸催化降解；2）被胃腸道內的酶水解；3）對胃腸道黏膜的透過(guò)性差；4）存在肝的首過(guò)效應。采用吸收促進(jìn)和新型微粒給藥系統（如微乳、納米粒、脂質(zhì)體）可提高其吸收。

       其他給藥途徑

       包括鼻腔給藥系統（鼻粘膜）、肺部給藥系統（肺粘膜）、直腸給藥系統、口腔黏膜和經(jīng)皮給藥系統。這些給藥途徑的優(yōu)點(diǎn)是均不同程度地避免了藥物的肝 臟首關(guān)效應，給藥部位蛋白水解酶的活性較低，藥物在給藥部位穩定性增強，其中鼻粘膜和肺粘膜給藥吸收較快。共同的缺點(diǎn)是生物利用度較低。

       如何促進(jìn)蛋白質(zhì)類(lèi)藥物的吸收

       提高吸收屏障的通透性

       加入化學(xué)類(lèi)吸收促進(jìn)劑，如脂肪酸、磷脂、膽鹽、苯基甘氨酸酰胺衍生物、酯和醚型的（非）離子表面活性劑、皂角苷類(lèi)、水楊酸酯衍生物、梭鏈孢酸、甘草酸衍生物或二甲基-β-環(huán)糊精；或通過(guò)離子導入技術(shù)和脂質(zhì)體載體技術(shù)提高通透性。

       降低吸收部位和吸收途徑肽酶的活性

       加入抑胰肽酶、桿菌肽、大豆酪氨酸抑制劑、硼酸亮氨酸、硼酸纈氨酸；分子結構修飾防止降解；延長(cháng)作用時(shí)間，如采用生物粘附技術(shù)。

       03  生物技術(shù)藥物制劑質(zhì)量評價(jià)的方法

       化學(xué)藥品一般具有純度很高，終產(chǎn)品中雜質(zhì)可以分析、確定且制訂限量，產(chǎn)品相對穩定的特點(diǎn)，因此可以通過(guò)對其最終產(chǎn)品的質(zhì)量檢測實(shí)現對化學(xué)藥品的全面質(zhì)量控制。大多數生物技術(shù)藥物目前上不可能做到這些。

       蛋白多肽類(lèi)藥物的質(zhì)量評價(jià)特點(diǎn)

       為了保證生物技術(shù)藥物產(chǎn)品的安全、有效、可控，必須從原料（包括菌、毒種）、生產(chǎn)工藝、半成品到成品進(jìn)行全程的質(zhì)量控制。蛋白質(zhì)、多肽類(lèi)藥物除對成品進(jìn)行質(zhì)量控制外，還應對中間半成品進(jìn)行質(zhì)量控制，并有相應的質(zhì)量控制標準，生物技術(shù)藥物一般不以原料藥的形式批準上市；但例外的類(lèi)別是胰島素，因其可形成晶態(tài)，在一定條件下可穩定保存。當然，隨著(zhù)液相及固相蛋白合成技術(shù)的進(jìn)步與成熟，目前肽類(lèi)藥物的質(zhì)量標準將在既往的基礎上又明顯提高。

       生物技術(shù)藥物的質(zhì)量控制

       傳統的生物技術(shù)藥物大多由活生物體（細菌或細胞）制備，具有復雜的分子結構，其生產(chǎn)涉及諸多生物學(xué)過(guò)程，如發(fā)酵、細胞培養、目的產(chǎn)物的分離純化等，在這些生產(chǎn)過(guò)程中，目標產(chǎn)品容易受到各種生物或理化條件等的影響，因此質(zhì)量控制標準與檢測方法在生物技術(shù)藥物研發(fā)中占有舉足輕重的位置。上游工作構建、篩選得到的候選目標產(chǎn)品需要在建立檢測控制方法和質(zhì)控標準后逐步確定中試工藝，而完成**評價(jià)、藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)研究等臨床前評價(jià)研究則需要工藝穩定、符合質(zhì)控標準的供試樣品，才能得到相對客觀(guān)、重現性好的評價(jià)數據；同時(shí)中試工藝等下游工作和臨床前評價(jià)研究所反映出的供試樣品問(wèn)題，可以促進(jìn)檢測控制方法和質(zhì)控標準的完善與提高，以進(jìn)一步優(yōu)化制備工藝，并積極推動(dòng)申請臨床研究的進(jìn)程。

       生物技術(shù)藥物質(zhì)量控制主要包括理化特性分析、生物學(xué)活性測定、殘留雜質(zhì)檢測和制劑相關(guān)的安全性及常規檢定等幾個(gè)方面。這里以基因工程蛋白質(zhì)類(lèi)生物技術(shù)藥物的質(zhì)量控制為例加以介紹。

       理化性質(zhì)鑒定

       理化性質(zhì)鑒定包括特異性、分子量、等電點(diǎn)、肽圖、吸收光譜、氨基酸序列等。特異性鑒定是利用蛋白的抗原性，根據抗原抗體特異反應對特定產(chǎn)品進(jìn)行鑒別，包括免疫印跡、免疫電泳、點(diǎn)免疫、免疫擴散等方法。蛋白質(zhì)分子量常采用質(zhì)譜法和還原型SDS-PAGE電泳法測定。等電點(diǎn)一般采用等電聚焦電泳或毛細管電泳法測定，并與標準品或理論值比較。重組蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)往往是不均一的，但重要的是在生產(chǎn)過(guò)程中批與批之間的電泳結果應一致，以反映其生產(chǎn)工藝的穩定性。等電點(diǎn)呈現多區帶往往是產(chǎn)品結構不均一的表現，如二硫鍵配對錯誤、構型改變、C端降解等。肽圖分析是指通過(guò)化學(xué)裂解法及蛋白酶裂解等各種手段，將蛋白斷裂成大小不均的多個(gè)肽段，通過(guò)SDS-PAGE電泳、反相HPLC、毛細管電泳、質(zhì)譜分析等各種手段分離檢測，對空間構象較復雜，或因裂解不完全、二硫鍵仍然將各個(gè)片段連接在一起的特殊產(chǎn)品，則先用還原劑打開(kāi)二硫鍵、封閉巰基后再按照常規方法進(jìn)行分析。通過(guò)與天然產(chǎn)品或參考品的蛋白質(zhì)一級結構作精密比較，肽圖分析可確證表達產(chǎn)物結構的正確性以及批件產(chǎn)品結構的吸收波特征，符合280nm左右紫外特征吸收峰。N末端氨基酸序列分析是重組蛋白質(zhì)和肽的重要鑒別標準，一般要求至少測15個(gè)氨基酸。有的蛋白質(zhì)以單鏈和從中間斷裂后形成鏈形式存在，這種情況就會(huì )測出兩個(gè)不同的N末端，所以在質(zhì)量標準中根據理論值可分別設定N末端為標準。N末端測序的基本原理為Edman化學(xué)降解法，目前已用蛋白質(zhì)全自動(dòng)測序儀進(jìn)行N-端氨基酸序列測定，靈敏度已達到pmol水平。

       生物活性、比活性測定

       生物學(xué)活性測定是重組蛋白質(zhì)類(lèi)藥物重要的質(zhì)控指標，包括體外測定法、體內測定法、酶促反應測定法和免疫學(xué)活性方法等。體外測定法是指重組蛋白質(zhì)類(lèi)藥物對培養細胞和離體動(dòng)物器官生物學(xué)功能的影響；體內測定法是利用動(dòng)物體內某些指標的變化確定產(chǎn)品的生物學(xué)活性單位；生化酶促反應測定法主要分析產(chǎn)品與底物或某種物質(zhì)結合后發(fā)生的物理化學(xué)反應，如重組鏈激酶溶栓活性測定，即利用其于纖溶酶原結合后可激活纖溶酶，從而在纖維蛋白瓊脂平板中形成溶圈；免疫學(xué)活性測定法采取酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等方法測定產(chǎn)品活性。蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性與其免疫學(xué)活性不一定相平行，只有蛋白肽鍵的抗原決定簇和生物活性中心相一致，ELISA法測定結果才能反映生物學(xué)活性。

       比活性是每毫克蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性單位，是進(jìn)行成品分裝的重要依據。蛋白質(zhì)的空間結構不能常規測定，蛋白質(zhì)空間結構的改變特別是二硫鍵的錯誤配對可影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，從而影響蛋白質(zhì)類(lèi)藥物的藥效，比活性可間接地反映這一情況。通過(guò)對原料藥比活性的檢測，不僅可反映產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的穩定性，而且還可以比較不同表達體系、不同生產(chǎn)廠(chǎng)家生產(chǎn)同一產(chǎn)品時(shí)的質(zhì)控情況。一般比活性的標準可根據中試工藝優(yōu)化后的多次檢定結果統計后定出。

       純度分析

       重組蛋白純度分析一般采用HPLC和SDS-PAGE方法。進(jìn)行SDS-PAGE分析時(shí)，結果應顯示單一條帶，純度一般應大于95%。HPLC法應根據不同的純化工藝選擇不同的方法，一般盡量采用與SDS-PAGE法原理不同的反相柱或其他離子交換柱進(jìn)行分析。進(jìn)行HPLC分析時(shí)結果應呈單一峰，經(jīng)積分計算產(chǎn)品純度一般大于95%。如出現主峰以外的其他相關(guān)物質(zhì)峰，則應對雜峰的性質(zhì)進(jìn)行分析。必要時(shí)，還需要采用適宜的方法測定相關(guān)蛋白（如異構體或缺失體）的含量，并制定對應的限量標準。

       含量測定

       蛋白質(zhì)含量測定是生物技術(shù)藥物質(zhì)量控制的重要指標之一，其準確性對產(chǎn)品規格、分裝量具有指導意義，是比活性計算、殘留雜質(zhì)的限量控制以及其他理化特性測定的基礎，也是臨床前安全和有效性評價(jià)研究中有效劑量、**劑量設置以及臨床方案制訂的重要依據。測定方法包括凱氏定氮法、Lowry法、BCA法、染色法、紫外吸收法、ELISA法和HPLC法等。其中Lowry法是經(jīng)常使用的方法。

       二硫鍵分析

       二硫鍵形成是一種常見(jiàn)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，對穩定蛋白質(zhì)的空間結構，保持及調節其生物活性有非常重要的作用。因此，確定二硫鍵在蛋白質(zhì)中的位置是全面了解含二硫鍵蛋白質(zhì)化學(xué)結構的重要方面。

       目前常用的定位二硫鍵的方法分為非片斷法和片斷法。非片斷法包括X射線(xiàn)衍射晶體結構分析法、多維核磁共振波譜法和合成對照法等。片斷法包括對角線(xiàn)法、二硫鍵異構及突變分析法、酶解法和化學(xué)裂解法、部分還原測序法以及氰化半胱氨酸裂解法等。這些方法各具特點(diǎn)，也有各自的局限性。隨著(zhù)質(zhì)譜儀器在質(zhì)量檢測范圍、分辨率、靈敏度、準確度和分析速度等方面的不斷發(fā)展，使質(zhì)譜法更加適合二硫鍵的分析。二硫鍵的定位現多采用生化、質(zhì)譜及測序等多種方法相結合來(lái)進(jìn)行。

       殘余雜質(zhì)檢查

       殘余雜質(zhì)可能具有**，也影響產(chǎn)品的生物學(xué)活性或使產(chǎn)品變質(zhì)，可反映產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的穩定性。殘余雜質(zhì)可分為外來(lái)污染物和產(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì)兩大類(lèi)，外來(lái)污染物包括微生物污染、熱源、細胞成分（例如細胞蛋白質(zhì)、DNA等）、培養基中的成分、來(lái)自生產(chǎn)過(guò)程的物質(zhì)；殘留雜質(zhì)限度設定是控制質(zhì)量的重要手段。

       制劑相關(guān)的安全性及常規檢定

       重組蛋白質(zhì)藥物制劑相關(guān)的安全性及常規檢定一般包括外觀(guān)、裝量、pH、水分、無(wú)菌實(shí)驗、異常**等。凍干是保證產(chǎn)品有效期內穩定性的重要工藝。水分檢測主要針對凍干制劑，目前水分國際公認標準為不超過(guò)3.0%，所采用的方法有化學(xué)法（Fischer法）和稱(chēng)量減重法。近年來(lái)也有一些基因工程藥物采用水針劑性，需要提供穩定性試驗的資料，以證明在有效期內生物學(xué)活性不會(huì )明顯降低；如果添加了其他化學(xué)穩定劑，也要提供安全性的資料。裝量實(shí)驗、pH檢測和無(wú)菌實(shí)驗對凍干制劑、水針劑性都是必要的。注射用制品無(wú)菌實(shí)驗有增菌培養法和濾膜法，口服或外用制劑菌檢項目有需氧菌、厭氧菌、真菌和支原體。異常**試驗是主要檢查生產(chǎn)工藝中是否含有目標產(chǎn)品意外的有毒物質(zhì)。上市外觀(guān)、裝量、pH、水分、無(wú)菌實(shí)驗、異常**等檢測方法按《中國藥典》規定的標準進(jìn)行。

       小結

       以上不難看出，生物技術(shù)藥物與化學(xué)藥物相比較，藥學(xué)研究方面存在很多不同之處，其所關(guān)注的質(zhì)量控制的項目和關(guān)鍵點(diǎn)，對于化學(xué)藥開(kāi)發(fā)人員來(lái)說(shuō)，概念還是比較模糊的。且當前所公開(kāi)公布的生物藥藥學(xué)研究資料相對較少，遠不如化學(xué)藥藥學(xué)研究資料之多。但生物技術(shù)藥物的發(fā)展已經(jīng)與化學(xué)藥并列前行，理解生物藥藥學(xué)研究可以更好使我們理解藥物。筆者也是本著(zhù)學(xué)習的態(tài)度，在接下來(lái)的文章中，將繼續介紹生物技術(shù)藥物的臨床前藥理毒理評價(jià)，及藥動(dòng)學(xué)信息，以期與大家共同進(jìn)步。

       參考：

       1. 《藥品注冊管理辦法》

       2. 《新藥研究與評價(jià)概論》.李曉輝，杜冠華。

       3. 《化學(xué)藥品和治療用生物制品研究指導原則-試行》

       4. 《生物類(lèi)似藥研發(fā)與評價(jià)技術(shù)指導原則（試行）》2015

       5. 生物類(lèi)似藥研發(fā)相關(guān)問(wèn)題問(wèn)與答. CDE官網(wǎng)