新型冠狀病毒肺炎疫情在國內已逐漸平穩，全球疫情卻正處爆發(fā)期。當各國不得不開(kāi)始重視起疫情的控制時(shí)，首先要解決的就是新型冠狀病毒的檢測問(wèn)題。回顧國內的抗疫歷程，我們很早就確立了核酸檢測作為新型冠狀病毒肺炎的診斷金標準，但曾有很多臨床醫生強烈反映核酸檢測出現了“假陰性”的情況，即對于一些臨床、影像學(xué)和流行病學(xué)特征都高度提示新冠的患者，核酸檢測結果卻為陰性，甚至有的患者需要3次以上核酸檢測才第一次返回陽(yáng)性結果。要理解并解決“假陰性”的問(wèn)題，我們需要對新型冠狀病毒的檢測原理和過(guò)程有一個(gè)基礎的了解。
一、新型冠狀病毒核酸檢測，到底在檢測什么？
新型冠狀病毒的檢測目前有2種方法，第一種是核酸檢測，第二種是抗體檢測。核酸檢測的對象是病毒的RNA，抗體檢測的對象是機體在免疫過(guò)程中產(chǎn)生的與病毒蛋白特異性結合的抗體。
RNA可以理解為病毒的遺傳密碼，是由數萬(wàn)個(gè)密碼子連接而成的單鏈密碼串。對RNA的檢測實(shí)際上只需要選擇這長(cháng)串密碼中特異性的位點(diǎn)，如果特異性位點(diǎn)中的密碼序列符合，那么就可以確認標本中存在新型冠狀病毒。實(shí)際檢測中，現有的核酸檢測都是檢測DNA的，所以在對標本處理得到基因組RNA之后，往往需要將RNA逆轉錄為互補的cDNA。熒光RT-PCR是目前使用最廣泛的新型冠狀病毒核酸檢測方法，因其具有優(yōu)異的靈敏度和特異性并且快速簡(jiǎn)單成本低。熒光RT-PCR的原理是首先把cDNA在PCR反應體系中進(jìn)行擴增并使用熒光進(jìn)行標記，每擴增一條DNA 鏈，就有一個(gè)熒光分子產(chǎn)生（圖2）。通過(guò)測定熒光達到一定閾值所需擴增循環(huán)數（Ct 值）來(lái)實(shí)現靶標定量檢測。初始靶標核酸的濃度越高，Ct 值越小。由于SARS-CoV-2屬于RNA病毒，容易發(fā)生變異，為防止錯檢和漏檢，PCR檢測一般會(huì )分別在ORF1ab基因、N基因選取2個(gè)靶標，有時(shí)還會(huì )在E基因上選取第3個(gè)靶標，以提高SARS-CoV-2的陽(yáng)性檢出率。
全基因組測序是新型冠狀病毒檢測的另外一種核酸檢測方法。對病毒進(jìn)行全基因組測序 可以幫助我們了解病毒的遺傳信息，最初新型冠狀病毒的鑒別就是通過(guò)基因測序進(jìn)行的，測序結果可以用于指導核酸檢測產(chǎn)品（如熒光RT-PCR）的設計，并對病毒進(jìn)行追蹤和溯源。測序技術(shù)的最大優(yōu)勢在于高敏感性、高準確性，但測序技術(shù)由于儀器成本較高，依賴(lài)于專(zhuān)業(yè)人員對序列的解讀，且檢測時(shí)間較長(cháng)，目前還不適用于大規模檢測。此外，其他核酸檢測方法還包括液滴數字PCR，基因芯片等，這些核酸檢測方法可以進(jìn)一步改善檢測的效率和精度，但由于設備和操作流程要求較高，也不適合緊急疫情期間的大規模應用。由于RNA病毒容易發(fā)生變異，為防止錯檢和漏檢，用于SARS-CoV-2檢測的PCR檢測一般會(huì )分別在ORF1ab基因、N基因選取兩個(gè)靶標，有時(shí)還會(huì )在E基因上選取第3個(gè)靶標，以提高SARS-CoV-2的陽(yáng)性檢出率。
新型冠狀病毒抗體檢測原理是基于抗體與抗原的特異性結合這一特性，抗體是人體免疫系統產(chǎn)生用于對抗抗原的物質(zhì)。在人體感染SARS-CoV-2后，病毒會(huì )作為抗原刺激人體免疫細胞產(chǎn)生抗體，因此可以通過(guò)檢測人體內是否產(chǎn)生特異性的抗體來(lái)間接檢測是否感染SARS-CoV-2。檢測的抗體主要分為免疫球蛋白M（IgM）和免疫球蛋白G（IgG）兩類(lèi)。lgM是機體初次免疫應答產(chǎn)生的抗體，一經(jīng)感染，立即產(chǎn)生，但持續時(shí)間不長(cháng)，主要作為早期感染的指標。lgG是機體再次免疫應答產(chǎn)生的抗體，產(chǎn)生時(shí)間晚，持續時(shí)間長(cháng)，主要作為感染和既往感染的指標。一般認為在發(fā)病7天后體內才開(kāi)始出現IgM抗體，發(fā)病15天后開(kāi)始出現IgG抗體。同時(shí)檢測lgM、lgG抗體可以提高檢測的準確性，減少漏診。抗體檢測的樣本主要是血清、血漿或全血。目前使用最廣泛的新型冠狀病毒抗體檢測方法為免疫色譜試紙條，其原理為預先在試紙條的檢測線(xiàn)（T線(xiàn)）上固定抗體（抗原檢測）或抗抗體（抗體檢測），在控制線(xiàn)（C線(xiàn)）上固定二抗，結合墊帶有免疫標記的探針。一般探針為膠體金、乳膠粒子或熒光微球等具有比色或熒光信號的微顆粒。在樣品墊中加入待測樣本，樣本流至結合墊時(shí)，通過(guò)抗原–抗體相互作用與探針結合，形成樣本–探針復合物。當流動(dòng)至T線(xiàn)時(shí)，復合物會(huì )被T線(xiàn)上的抗體或者抗抗體捕獲，形成標記三明治夾心結構復合物，使T線(xiàn)顯色。T線(xiàn)和C線(xiàn)同時(shí)顯色表明待測標本中含有病毒的抗原或者抗體，只有C線(xiàn)則表明無(wú)病毒抗原或抗體。免疫色譜試紙條法無(wú)需復雜的儀器，操作簡(jiǎn)單，可直接目視判定結果，檢測時(shí)間只需十幾分鐘，適合于現場(chǎng)快速篩查。但其準確度和靈敏度有限，可以作為新型冠狀病毒檢測的輔助方法。
二、核酸檢測為什么是診斷金標準，“假陰性”如何解釋?zhuān)?/strong>
核酸檢測之所以是新型冠狀病毒肺炎診斷的金標準，是因為核酸檢測在本質(zhì)上是一種病原學(xué)檢測，即在標本中檢測到了SARS-CoV-2特有的基因片段，那么除非標本被污染，可以肯定患者存在SARS-CoV-2感染。目前嚴格執行"三個(gè)陰性樣本隨機放在臨床標本中間同時(shí)參與檢測全過(guò)程"的質(zhì)控策略，可以有效而及時(shí)地識別出標本被污染的情況。臨床醫生曾反映強烈的核酸檢測"假陰性"概念，往往指的是患者的臨床癥狀及影像學(xué)證據高度疑似新型冠狀病毒肺炎，但2019-nCoV核酸檢測多次或始終為"陰性"。而對于檢驗實(shí)驗室而言，假陰性指的是所采集標本中存在有足夠量的病毒，但卻沒(méi)有被檢出。導致“假陰性”的可能原因包括：
被感染者細胞內的病毒量不足：不同病程階段以及機體不同部位存在的病毒量有所不同，例如感染初期可能體內病毒量較低而無(wú)法檢出；不同部位中，肺泡灌洗液中最容易檢出病毒核酸，其次是深咳痰，再是鼻咽部，再次是口咽部。
標本采集時(shí)未采集到含病毒的細胞：采集部位不當，如采集口咽拭子時(shí)，采集深度不夠；采集鼻咽拭子沒(méi)有采到鼻腔深處等，則可能采集到的細胞絕大部分都是不含病毒的細胞。
檢測試劑的可靠性不足：任何一種檢測試劑的檢測范圍都存在下限，病毒數量低于檢測下限時(shí)是無(wú)法檢出的。此外，若原始標本中病毒數量低于一定程度，就很可能在核酸擴增檢測的反應體系中沒(méi)有病毒核酸，試劑也就無(wú)法檢出。
實(shí)驗室質(zhì)量控制不規范：例如未嚴格遵守標本運輸的溫度和時(shí)間要求，檢測操作或者結果判讀不嚴謹等。
根據中華醫學(xué)會(huì )檢驗醫學(xué)分會(huì )發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎病毒核酸檢測專(zhuān)家共識》，新型冠狀病毒檢測陽(yáng)性結果的報告要求滿(mǎn)足以下任一條：（1）ORF1ab和N基因同時(shí)陽(yáng)性時(shí)，判定為陽(yáng)性；（2）若僅ORF1ab或N基因其中之一檢測結果陽(yáng)性時(shí)，需重新提取原標本的核酸進(jìn)行復查，復查后ORF1ab或N基因仍為陽(yáng)性時(shí)，判定為陽(yáng)性。陰性結果的報告要求為兩個(gè)位點(diǎn)擴增結果都無(wú)反應。其余情況都認為“可疑結果”，需要換用不同廠(chǎng)家或者敏感度更高的檢測方法進(jìn)行確認，并建議建議臨床重新采集標本或更換部位采集標本再次檢測。對于核酸檢測報告的陰性結果，需要結合患者的臨床特征進(jìn)行綜合判定，如果患者的癥狀、流行病學(xué)和胸部CT表現都高度提示感染時(shí)，很可能是因為標本中病毒量低于檢測下限而未被檢出，該情況下建議重新采集標本或者更換標本采集部位后再次檢測。
三. 目前已有哪些可商用的新型冠狀病毒檢測試劑？
截至目前，國家藥品監督管理局共批準新冠病毒核酸檢測試劑11個(gè)，抗體檢測試劑8個(gè)（如圖4）需要注意的是，正常情況下一種檢測試劑在臨床應用之前都需要進(jìn)行性能驗證，以確保檢測試劑的性能可以滿(mǎn)足臨床需要，但疫情突發(fā)，已獲批的所有新型冠狀病毒檢測試劑都是屬于應急審批，所有的檢測試劑產(chǎn)品都未經(jīng)過(guò)充分的性能驗證。即便如此，通過(guò)應急審批的檢驗試劑也很大程度地滿(mǎn)足了國內新型冠狀病毒肺炎診斷的需求。此外，在保障我國病毒檢測需要的基礎上，已有越來(lái)越多的國產(chǎn)冠狀病毒檢測試劑獲得歐盟認證或經(jīng)NGO機構進(jìn)行捐贈，馳援全球。
參考文獻：[1]國家衛生健康委辦公廳.新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）. 2020年3月3日印發(fā).
[2]Lu R, Zhao X, Li J, et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 2020;395(10224):565–574. doi:10.1016/S0140-6736(20)30251-8
[3]董召剛, 鄒明瑾, 張義. 新型冠狀病毒肺炎核酸檢測現狀及研究進(jìn)展 [J/OL] . 中華檢驗醫學(xué)雜志,2020,43 (2020-03-05).http://rs.yiigle.com/yufabiao/1183778.htm. DOI: 10.3760/cma.j.cn114452-20200226-00128.[網(wǎng)絡(luò )預發(fā)表].
[4]中華醫學(xué)會(huì )檢驗醫學(xué)分會(huì ). 新型冠狀病毒肺炎病毒核酸檢測專(zhuān)家共識 [J] . 中華醫學(xué)雜志,2020,100( 00 ): E003-E003. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2020.0003
[5]張瑞, 李金明. 如何減少新型冠狀病毒核酸檢測的"假陰性" [J] . 中華醫學(xué)雜志,2020,100( 00 ): E008-E008. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2020.0008
[6]王露瑩,陳品儒,鄭國灣,漆楠,楊科.新型冠狀病毒檢測方法的研究進(jìn)展[J/OL].現代藥物與臨床:1-5.
[7]澎拜新聞. 首先質(zhì)量要過(guò)關(guān)！首個(gè)新冠病毒檢測試劑盒誕生全程復盤(pán). 來(lái)源：https://www.thepaper.cn/newsDetail_forward_5754281
[8]第一財經(jīng). 共擊疫情，中國新冠病毒檢測試劑盒馳援全球.來(lái)源：https://www.yicai.com/news/100561666.html
（注：原文有刪減）
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