工藝設備中生物膜的形成會(huì )導致后續GMP生產(chǎn)中的一系列問(wèn)題。工藝設備表面由革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、霉菌和細菌孢子等組成的生物膜會(huì )影響到使用此設備生產(chǎn)的產(chǎn)品的安全性、成分、規格、質(zhì)量和純度，并可能進(jìn)一步導致產(chǎn)品污染、危害消費者從而受到法規懲罰。

       FDA關(guān)于微生物污染的法規如下：

       "21 CFR 211.113 Control of Microbiological Contamination"

       (a)對于非無(wú)菌藥品生產(chǎn)，需要設立并遵守適當的書(shū)面操作流程以預防有害微生物污染。

       (b) 對于無(wú)菌藥品生產(chǎn)，需要設立并遵守適當的書(shū)面操作流程以預防有害微生物污染。此類(lèi)操作流程需要包括所有無(wú)菌和滅菌工藝的驗證。

       如下文中的例子，產(chǎn)品的微生物污染通常會(huì )導致召回。

       這家公司聲稱(chēng)其在2017年8月1日至2018年4月生產(chǎn)的產(chǎn)品中，有一"小部分"微生物污染檢測結果為陽(yáng)性。2018年7月，這家公司宣布因為在FDA例行檢查中發(fā)現有布氏假單胞菌、熒光假單胞菌和多噬伯克霍爾德氏菌污染召回4個(gè)批次的產(chǎn)品。(1)

       FDA法規和上述產(chǎn)品召回的案例證明微生物污染對于藥品生產(chǎn)者和監管者而言都是明確的關(guān)注點(diǎn)。任何在生產(chǎn)現場(chǎng)發(fā)生的微生物污染問(wèn)題都需要用適當和徹底的調查以及強有力的糾正和預防措施來(lái)處理。

       本文將會(huì )闡述生物膜的生命周期、可能會(huì )引起生物膜形成的條件或因素以及生物膜問(wèn)題處理的方法。這些內容可以幫助藥品生產(chǎn)者前攝性地采取適當的操作流程以盡可能減少生物膜污染的風(fēng)險。

       Biofilm Lifecycle 生物膜的生命周期

       微生物一般是浮游性的，例如在培養基中根據代謝和生產(chǎn)特性處于未貼壁或自由懸浮狀態(tài)。最近的研究發(fā)現微生物也可以在材料表面附著(zhù)、生長(cháng)，形成復雜的微生物群落。這一現象引發(fā)了后續關(guān)于表面附著(zhù)微生物（生物膜）性質(zhì)的研究。

       生物膜到底是什么？一般認為，生物膜是由多種微生物組成的生物群落，其外包被有黏滑的、由多糖、核酸和蛋白組成的結構復雜的"胞外多聚物基質(zhì)"。

       以下是生物膜生命周期的三個(gè)主要階段：

       Diagram 1: Biofilm Lifecycle

       第一階段：附著(zhù)

       自由浮動(dòng)的或浮游的細菌細胞在潮濕環(huán)境下可以附著(zhù)在材料表面并開(kāi)始分泌被稱(chēng)為胞外多聚物基質(zhì)（EPS）的黏滑、膠狀基質(zhì)。附著(zhù)在表面的微生物可以是單一種屬，也可以由多種細菌、真菌、藻類(lèi)、酵母、原生動(dòng)物或其他微生物以及細胞碎片和腐蝕產(chǎn)物組成。

       第二階段：生長(cháng)

       在胞外多聚物基質(zhì)的保護下，生物膜可以快速成長(cháng)為具有復雜三維結構的群落，視環(huán)境條件從若干層細胞到幾英寸厚不等。

       第三階段：脫落

       生物膜生長(cháng)成熟后，大小不等的細胞團塊和碎片可以從其三維結構上脫離，使得原群落中的細菌可以散播并附著(zhù)到下游的其他表面或生物膜群落上。

       生物膜污染經(jīng)常反復發(fā)生。短時(shí)間內污染問(wèn)題可能表現為受控狀態(tài)。但是如果針對生物膜的去除和處理措施不夠有效，一段時(shí)間后仍然可能發(fā)現污染。

       形成生物膜的影響因素

       下文的表2列舉了一些工藝設備中可能會(huì )導致生物膜形成的因素。

       ? 設備/工藝：管道中流速小于1.5 m/s會(huì )增加微生物附著(zhù)在管道表面的可能性。死角是指工藝設備中一些液體容易潴留且不易和清洗劑和水充分交換的部位。長(cháng)徑比（L/D）大于1.5的死角易形成潴留液體、積累殘留或微生物。非衛生級閥門(mén)易積累殘留且不易清洗，通常建議使用衛生級閥門(mén)如隔膜閥或夾管閥。管路的不適當坡度會(huì )影響排水能力，從而增加液體潴留在系統中的可能。通常建議的管路坡度為0.5% - 1%（每1米下降0.5到1厘米）以保證排水能力。

       ? 表面粗糙度：通常用Ra，即輪廓算數平均偏差來(lái)衡量某一材料的表面粗糙度。不銹鋼表面的腐蝕會(huì )增加其表面粗糙度。在此情況下，其表面會(huì )更不容易清洗。因此常規的清洗操作流程有可能不能有效去除粗糙表面的殘留。而這些產(chǎn)品殘留會(huì )給生物膜的生長(cháng)提供良好的條件。

       ? 殘留：開(kāi)發(fā)清洗工藝（包括使用合適的清洗試劑、時(shí)間、清洗劑濃度和溫度）時(shí)需要考慮的重要因素。開(kāi)發(fā)出來(lái)的清潔工藝必須證明能夠持續有效地去除產(chǎn)品殘留。產(chǎn)品殘留除了會(huì )影響殺菌或滅菌工藝的有效性，同時(shí)也為微生物生長(cháng)提供了營(yíng)養源。

       Diagram 2: Factors leading to Biofilm Formation

生物膜問(wèn)題處理

       工藝設備中生物膜問(wèn)題存在的最初信號之一是微生物檢測中頻繁發(fā)生微生物超標。胞外多聚物基質(zhì)（EPS）保護了生物膜中的微生物并增加了其對于殺菌和清洗工藝的抵抗能力。如果一家工廠(chǎng)遭遇了反復發(fā)生的微生物污染事件，其首要任務(wù)是確定和徹底清除微生物污染的來(lái)源。關(guān)于生物膜問(wèn)題經(jīng)常問(wèn)到的問(wèn)題是："如何徹底清除生物膜？"

       一旦在系統中發(fā)現有可能的生物膜問(wèn)題，需要采取生物膜處理措施以去除生物膜殘留并同時(shí)對整個(gè)設備進(jìn)行滅菌。這類(lèi)處理措施通常可以分為三步。

       ? Step 1:

       使用堿性配方清洗劑以穿透EPS并使EPS失活。配方清洗劑中的表面活性劑能夠有效地穿透EPS并使EPS失活。去除EPS保護層對徹底清除生物膜非常重要。

       ? Step 2:

       酸洗和鈍化

       不銹鋼表面的腐蝕或紅銹經(jīng)常伴隨生物膜問(wèn)題一同存在。在這種情況下，需要對腐蝕/銹蝕表面進(jìn)行除銹和鈍化以修復不銹鋼表面的鈍化膜。如果沒(méi)有發(fā)現紅銹問(wèn)題則可以省略這一步。

       ? Step 3:

       使用殺孢子劑或高溫蒸汽對整個(gè)系統進(jìn)行滅菌

       這一步通過(guò)使用殺孢子劑（例如過(guò)氧化氫/過(guò)乙酸混合物、異丙醇、乙醇或高溫蒸汽滅菌）徹底清除工藝系統中殘存的微生物。

       美國環(huán)保署（EPA）有兩種標準測試方法來(lái)評估消毒試劑對于兩種易形成生物膜的微生物（綠膿假單胞菌和金黃色葡萄球菌）的效力，并同時(shí)作為這些產(chǎn)品標簽聲明的法規指南。如果一家消毒產(chǎn)品供應商希望在其廣譜消毒劑的標簽上添加硬質(zhì)無(wú)孔表面去除生物膜的聲明，這些測試方法和指南為其提供了一個(gè)框架。

       ? EPA MLB SOP MB-19: Growing a Biofilm using the CDC Biofilm Reactor

       ? EPA MLB SOP MB-20: Single Tube Method for Determining the Efficacy of Disinfectants against Bacterial Biofilm

       在生物膜問(wèn)題處理策略中，通常推薦使用標簽上帶有生物膜去除聲明的廣譜消毒劑。

       預防性措施

       俗語(yǔ)有言："一份預防勝過(guò)十分治療"。通過(guò)以下措施前攝性地預防生物膜的形成是更好的策略。

       ? 工藝設備的易清洗性。工藝設備的工程設計應考慮到易于清洗，如衛生級設計和配件。

       ? 使用合適的清洗試劑和清洗參數有效地去除工藝設備上的殘留。

       ? 使用酸性清洗劑定期進(jìn)行不銹鋼設備的維護。

       ? 優(yōu)化清洗/殺菌頻率以保持設備處于潔凈狀態(tài)。

       ? 對于收集到的微生物數據進(jìn)行例行的趨勢分析可以幫助管理者知曉工藝系統微生物控制的狀態(tài)以及對于不良趨勢可以采取早期介入。

       結論

       理解生物膜的生命周期、特性和處理方法十分重要。此外，制藥、生物制藥和醫療器械生產(chǎn)工藝中的生物負載控制取決于多種因素。這些因素包括有效的清洗工藝、良好的工程設計、定期的設備維護程序和持續性的檢測和趨勢分析。這些預防性的措施可以盡可能減少生產(chǎn)設施中的微生物污染風(fēng)險，確保任何生產(chǎn)出來(lái)的藥品對患者和消費者都是安全的。

       參考文獻

       1) Pharmaceutical Technology Editors (Aug 22, 2018), King Bio Recalls Products Due to Microbial Contamination (http://www.pharmtech.com/king-bio-recalls-products-due-microbial-contamination)

       2) Lopolito, P., and E. Rivera. "An Audit Approach to Address Microbial Contamination in Process Equipment." In Contamination Control in Healthcare Product Manufacturing, 2013, co-published by PDA and DHI

       3) Cleanroom Technology, Strategies for Biofilm Remediation, A. Deal, D. Klein and P. Lopolito Jul 2015.

       4) STERIS internal document, Tech Tip #3088 - General Cleaning Recommendation for Removal of Microbial Residue

       作者簡(jiǎn)介：

       Richard Chai

       技術(shù)服務(wù)經(jīng)理

       史帝瑞生命科學(xué)

       Richard Chai先生（以下簡(jiǎn)稱(chēng)Richard）目前任職史帝瑞技術(shù)服務(wù)經(jīng)理，致力于為客戶(hù)提供潔凈室清潔和微生物污染水平控制相關(guān)的技術(shù)培訓（包括消毒劑驗證、產(chǎn)品接觸表面的清潔和清潔驗證）。他同時(shí)還是ISPE會(huì )議的講師。

       加入史帝瑞之前，Richard有過(guò)13年在干粉吸入器、生物無(wú)菌灌裝和包裝、醫療器械和生物醫藥設備制造和驗證相關(guān)的工作經(jīng)驗，因此對潔凈室的清潔和消毒要求、微生物污染水平控制的方法有深入的理解。Richard曾擔任過(guò)驗證咨詢(xún)專(zhuān)家，對許多制藥客戶(hù)在設備驗證、產(chǎn)品接觸表面的清潔驗證、消毒劑驗證和產(chǎn)品接觸/非接觸表面的清潔等方面提供驗證技術(shù)支持。