一

       背景概況

       單細胞測序技術(shù)是指能夠在單個細胞的水平上，對基因組或轉(zhuǎn)錄組進行高通量測序分析的一項新技術(shù)。與傳統(tǒng)高通量測序相比，單細胞測序不僅能夠分析相同表型細胞的異質(zhì)性，還能獲取難以培養(yǎng)微生物的遺傳信息以及珍貴的臨床樣本的信息，具有廣闊的應(yīng)用前景。

       細胞是生命的單位，目前大部分的基因檢測均是從組織中抽提DNA 來進行測序，得到的實驗結(jié)果往往是細胞群體中信號表達的均值，是對細胞群體進行整體表征，或者只代表其中在數(shù)量上占優(yōu)勢的細胞信息，單個細胞獨有的細胞特性往往被忽略。

       而大量研究發(fā)現(xiàn)在同一器官或組織的相同類型細胞也表現(xiàn)出顯著的異質(zhì)性，每個細胞都有其獨特的表達模式。例如實體瘤樣本的總RNA，一半以上來源于非癌細胞（成纖維細胞、淋巴細胞、巨噬細胞等），使得癌細胞的信號可能被隱藏。因此，采用均值對單個細胞進行表征是不合適的，可能會丟失許多關(guān)鍵信息。

       另一方面，傳統(tǒng)高通量測序方法，難以應(yīng)用在對自然界中難培養(yǎng)的微生物的研究、罕見循環(huán)腫瘤細胞的轉(zhuǎn)錄組分析、胚胎發(fā)生最早期的分化特征研究、腫瘤的非均質(zhì)性和微進化研究等精確程度較高的研究領(lǐng)域[1]。隨著細胞分選和測序技術(shù)進步，單細胞測序技術(shù)應(yīng)運而生。

       （一）單細胞測序技術(shù)頗受關(guān)注

       《Nature Methods》雜志將單細胞研究方法列為未來幾年最值得關(guān)注的技術(shù)領(lǐng)域之一?！禨cience》雜志將單細胞測序列為年度最值得關(guān)注的六大領(lǐng)域榜首。

      2008—2018年P(guān)ubmed中單細胞測序技術(shù)文獻數(shù)量變化

       數(shù)據(jù)來源：Pubmed，火石創(chuàng)造

       （二）單細胞測序技術(shù)流程

       1. 單細胞分離

       針對單個細胞研究時，首先將單個細胞進行分離，并確保其生物完整性不被破壞。目前常用的單細胞分離方法有連續(xù)稀釋法、顯微操作法、激光捕獲顯微切割術(shù)、拉曼鑷子技術(shù)、熒光激活細胞分選術(shù)和微流控技術(shù)等。

       2. 細胞溶解與基因組獲取

       對細胞進行溶解來獲取基因組（DNA或RNA），這步驟非常關(guān)鍵，應(yīng)盡量保證基因組的完整性。目前細胞溶解的方法可以分為3大類: 物理法、化學(xué)法和生物酶降解法。

       3. 全基因組擴增

       由于單個細胞中的基因含量無法達到測序儀的檢測線，因此需要對基因組進行擴增，目前方法都是利用 DNA 聚合酶和不同形式的引物來進行擴增的，包括特異性的、簡并的或雜合的引物。

       4.測序與數(shù)據(jù)分析

       對單個細胞進行測序，并對所得的數(shù)據(jù)結(jié)果進行分析。

       二

       單細胞測序技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)狀

       單細胞測序技術(shù)能夠快速確定成千上萬個細胞的精確基因表達模式，分析相同表型細胞的遺傳信息異質(zhì)性。目前已應(yīng)用于神經(jīng)生物學(xué)、器官生長、癌癥生物學(xué)、臨床診斷、免疫學(xué)、微生物學(xué)、胚胎學(xué)、產(chǎn)前基因診斷等多個領(lǐng)域。

       1. 癌癥研究

       細胞異質(zhì)性是腫瘤的重要特征。基因型異質(zhì)性是指同一腫瘤內(nèi)部存在具有不同基因型的腫瘤細胞，而表型異質(zhì)性是指同一腫瘤內(nèi)部存在具有不同基因表達譜和功能特征的腫瘤細胞。

       眾多科研工作者基于單細胞測序技術(shù)對腫瘤異質(zhì)性進行研究，鑒定癌變細胞及癌癥發(fā)展的過程。XU等[3]對腎腫瘤進行單細胞測序，發(fā)現(xiàn)腎腫瘤細胞之間的突變頻率和位置不盡相同，每個細胞的突變狀態(tài)和轉(zhuǎn)錄情況也均不相同，表明腎腫瘤更加具有異質(zhì)性，需要開發(fā)更加有效的細胞靶向療法。

       2. 發(fā)育研究

       哺乳動物早期胚胎發(fā)育階段的細胞數(shù)量極為稀少，其轉(zhuǎn)錄組分析尤其需要單細胞 RNA-Seq 技術(shù)。

       ZHONG等[4]給予2300個妊娠胚胎人腦前額葉細胞繪制出人腦前額葉胚胎發(fā)育轉(zhuǎn)錄組圖譜，發(fā)現(xiàn)在發(fā)育過程中，神經(jīng)干細胞、興奮性神經(jīng)元細胞、抑制性神經(jīng)元細胞以及星型膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞等六大類細胞占主導(dǎo)地位，揭示了神經(jīng)元產(chǎn)生和環(huán)路形成的分子調(diào)控機制。

       組織器官發(fā)育是單細胞 RNA-Seq 技術(shù)應(yīng)用的另一個重要領(lǐng)域。近年來陸續(xù)報道了多種組織器官(包括肺、腦、腎、血液和內(nèi)耳)發(fā)育過程。

       3. 微生物研究

       由于微生物中的基因含量較低以及樣本稀少等原因，傳統(tǒng)的測序方法無法對難以培養(yǎng)的微生物進行測序。基于精確程度較高，單細胞測序技術(shù)能夠?qū)蝹€微生物細胞進行測序，進而發(fā)現(xiàn)新的微生物，加深對微生物生命活動過程的認(rèn)知。SUZANNE等[5]對某個稀有海洋微生物進行了測序，通過分析表明該微生物與硫氧化有關(guān)，進而發(fā)現(xiàn)了參與有氧代謝有關(guān)的基因。

       三

       國內(nèi)外政府資金投入情況

       1. 國外政府投入情況

       目前，美國、歐盟等發(fā)達國家和地區(qū)政府對單細胞測序領(lǐng)域投入了大量資金，用于促進單細胞測序技術(shù)的優(yōu)化與各個領(lǐng)域的應(yīng)用[6]。

       自2008年起，美國開始資助單細胞測序相關(guān)項目，之后一直呈現(xiàn)平穩(wěn)增長趨勢。自2014年起，關(guān)于單細胞測序的經(jīng)費數(shù)及項目數(shù)量驟增，呈爆發(fā)性增長趨勢，表明美國近幾年對單細胞測序相關(guān)項目的重視。共資助 915 個項目，累計經(jīng)費 5. 39 億美元。

       另一方面，資助方向主要包括研究領(lǐng)域和應(yīng)用領(lǐng)域，可細分為分子和細胞基礎(chǔ)研究，感染性疾病、腫瘤、心血管與血液病和神經(jīng)**疾病研究，再生醫(yī)學(xué)與干細胞研究，生物多樣性研究，單細胞測序相關(guān)工具、方法的建立，試劑與儀器設(shè)備的開發(fā)，資源與平臺的建立等。

       2. 我國政府投入情況

       我國單細胞測序技術(shù)起步較晚，2010年，NSFC資助2個細胞測序相關(guān)研究項目，經(jīng)費77萬元。2013 年，隨著國際對單細胞測序領(lǐng)域的熱度提升，NSFC 投入1500 萬元用于相關(guān)研究，2014—2015 年資助項目數(shù)及資助金額雖然稍有回落，但2016 年又迅速增加至23項，超過2000 萬元。

       研究領(lǐng)域主要包括單細胞測序儀器和技術(shù)開發(fā)、腫瘤研究與監(jiān)測、胚胎發(fā)育、微生物基因組研究、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)、干細胞研究、神經(jīng)科學(xué)、在畜牧學(xué)、獸醫(yī)學(xué)中的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究、血液疾病等。

       3. 國內(nèi)外政府資金投入比較

       目前，我國 NSFC、“863 計劃”和國家重點研發(fā)計劃累計在單細胞測序領(lǐng)域資助經(jīng)費約 1 億元，明顯低于美國不完全統(tǒng)計的 5.4 億美元，甚至英國的4千萬英鎊。

      美國和中國對單細胞測序技術(shù)的資金投入情況

       數(shù)據(jù)來源：參考文獻[6]

       四

       小結(jié)

       單細胞測序以單個細胞為單位，通過全基因組或轉(zhuǎn)錄組擴增，進行高通量測序，能夠揭示單個細胞 的基因結(jié)構(gòu)和基因表達狀態(tài)，反映細胞間的異質(zhì)性，在腫瘤、發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，正成為生命科學(xué)研究的焦點。

       單細胞測序技術(shù)在生物多樣性研究和細胞群體遺傳異質(zhì)性研究方面具有強大優(yōu)勢，將為生命科學(xué)研究人員提供全新的視角研究生命活動。我國在單細胞測序相關(guān)項目中的資助力度仍顯不足，隨著單細胞測序技術(shù)的深度和廣度逐漸加強，仍需加大對該領(lǐng)域的資金支持，并充分利用現(xiàn)有資源推動單細胞測序技術(shù)的進步與應(yīng)用。

       參考文獻

       [1] 朱忠旭,陳新.單細胞測序技術(shù)及應(yīng)用進展[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2015,34(5):902-908.

       [2] 董燕,宋程程,黃鶴.單細胞測序技術(shù)研究進展[J].化學(xué)工業(yè)與工程,2015,32(1):71-78.

       [3] Xu X, Hou Y, Yin X, et al.Single-cell exome sequencing reveals single-nucleotide mutation char-acteristics of a kidney tumor[J]. Cell, 2012, 148(5): 886-895.

       [4] Zhong S, Zhang S, Fan X,et al.A single-cell RNA-seq survey of the developmental landscape of the human prefrontal cortex [J].Nature,2018, 555(7697):524-528.

       [5] Suzanne D L, Bruer S L, Edgmont C A, et al .Ubiquitous dissolved inorganic carbon assimilation by marinebacteria in the Pacific Northwest coastal ocean as determined by stable isotopeprobing[J].PloS One,2012(7): e46695.

       [6]李愛花,唐小利.美、英及我國政府對單細胞測序研究及應(yīng)用領(lǐng)域的基金資助[J].中華醫(yī)學(xué)圖書情報雜志,2017,26(9):44-51.

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