慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染在全球范圍內是導致肝 臟疾病的常見(jiàn)原因，在東南亞地區疾病負擔尤其嚴重。根據世界衛生組織（WHO）估計，全球有大約2.57億HBV感染患者。目前，**、核苷或核苷酸（NUC）類(lèi)藥物不但能夠降低新感染率（new infection rates），而且對于堅持長(cháng)期病毒抑制療法的HBV患者來(lái)說(shuō)，能夠延緩肝病的進(jìn)展。然而科學(xué)和醫學(xué)界并不滿(mǎn)足于現狀，他們已經(jīng)開(kāi)始共同努力，開(kāi)發(fā)旨在治愈這一感染的創(chuàng )新抗病毒 藥物和免疫學(xué)療法。近日Nature Reviews Drug Discovery上的一篇綜述對目前治療HBV感染的研發(fā)策略進(jìn)行了全面的盤(pán)點(diǎn)。藥明康德內容團隊今天將與讀者分享這一綜述的精彩內容。

       功能性治愈HBV感染面對的挑戰

       共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）

       HBV能夠在被感染細胞的細胞核中生成cccDNA和整合序列。這些序列是病毒蛋白的轉錄模板。cccDNA是生成前基因組RNA（pgRNA）的模板。pgRNA提供了逆轉錄和病毒基因組復制所需的模板。

       cccDNA是一個(gè)病毒微型染色體（minichromosome），它是導致病毒在受到感染的細胞中長(cháng)期存在的原因。它的半衰期非常長(cháng)，目前的標準療法不能有效清除cccDNA。

       ▲cccDNA的表觀(guān)遺傳學(xué)調控（圖片來(lái)源：參考資料[2]）

       HBV的特殊免疫特征

       HBV具有的一些重要免疫學(xué)特征讓它們能夠長(cháng)期存在并且不易清除。HBV在肝細胞內的復制不會(huì )被細胞內的先天免疫系統察覺(jué)。HBV能夠生成和分泌大量病毒抗原，逐漸改變和耗竭HBV特異性T細胞和B細胞的功能。即便使用目前的標準療法，免疫反應的缺陷導致患者很難將HBV特異性免疫力恢復到正常水平，因而無(wú)法有效控制感染。

       HBV的生命周期和創(chuàng )新治療手段

       HBV的基因組是長(cháng)為3.2kb的松弛環(huán)狀DNA（rcDNA）基因組。它與聚合酶一起包裝在病毒衣殼中，外面覆蓋著(zhù)包膜蛋白（HBsAgs）。HBV的生命周期可以分為以下幾步：

       HBV通過(guò)與肝細胞表面的NTCP受體相結合進(jìn)入細胞，而后，病毒脫去包膜蛋白，衣殼進(jìn)入細胞核，釋放環(huán)狀DNA。宿主的DNA修復機制會(huì )將這些外源DNA轉換成cccDNA。它們與宿主的組蛋白和其它蛋白一起包裝成微型染色體。這種微型染色體是肝細胞核中長(cháng)期存在的病毒基因組儲備庫，它的數量可以通過(guò)感染新肝細胞和細胞間核衣殼的回收而不斷增加。

       cccDNA是生成pgRNA的模板，它需要肝炎X蛋白（HBx）才能維持正常表達。cccDNA轉錄生成6種RNA，其中包括與HBV聚合酶結合的pgRNA。

       與pgRNA 結合的聚合酶通過(guò)與核蛋白和P蛋白構成的6聚體結合，啟動(dòng)核衣殼的組裝。

       prgRNA在未成熟的核衣殼內引導松弛環(huán)狀DNA的合成，生成成熟的核衣殼。

       成熟核衣殼如果與HBsAg相結合，會(huì )引發(fā)病毒獲得包膜蛋白，并且被釋放到細胞外。

       ▲HBV的生命周期（圖片來(lái)源：參考資料[2]）

       目前，多種創(chuàng )新療法可以靶向HBV生命周期中的這些步驟，達到降低病毒負荷的目的。

       防止HBV進(jìn)入細胞

       病毒的不斷復制和釋放會(huì )導致新的肝細胞被感染，從而維持慢性感染和cccDNA庫的穩定。在大多數患者中，NUC療法無(wú)法完全抑制病毒產(chǎn)生。因此，將病毒進(jìn)入抑制劑與復制抑制劑聯(lián)用是減少cccDNA庫的有力手段。

       防止病毒進(jìn)入細胞的方法包括開(kāi)發(fā)從HBsAg中衍生的多肽。它可以通過(guò)與NTCP受體結合，阻礙HBV病毒進(jìn)入細胞。例如Myrcludex B（又名bulevirtide），這款多肽作為單藥療法，能夠在48周之后，將HDV的RNA水平降低2.84 log。它與干擾素聯(lián)用的效果更好。

       除了多肽以外，小分子藥物（例如ezetimibe和環(huán)孢素衍生物）和靶向HBsAg的單克隆抗體也在研究中被用于阻斷HBV進(jìn)入細胞。

       直接靶向cccDNA

       抑制cccDNA的生成是一個(gè)有吸引力的策略。然而，我們需要對cccDNA合成的過(guò)程具備更全面的了解，才能靶向這一過(guò)程。因為cccDNA生成過(guò)程中的很多關(guān)鍵步驟需要宿主細胞核中的蛋白酶，微型染色體的形成也需要宿主的組蛋白和其它蛋白。抑制cccDNA生成的療法可能會(huì )靶向宿主蛋白，它們可能比靶向病毒蛋白的療法具有更多的毒副作用。

       鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases）可以被用來(lái)直接靶向cccDNA，這一策略在細胞培養模型中已經(jīng)能夠成功編輯HBV的cccDNA。

       基于CRISPR-Cas9的治療方法可以在cccDNA中加入突變或者缺失，導致cccDNA失活。臨床前研究表明，超過(guò)90%的HBV DNA可以被Cas9切割。然而，大約7%的cccDNA基因組在經(jīng)過(guò)CRISPR-Cas9介導的切割之后，能夠被修復成不影響cccDNA功能的狀態(tài)。因此，這一策略需要引入靶向cccDNA中不同位點(diǎn)的多個(gè)指導RNA（gRNA），確保cccDNA的失活。

       基因編輯療法的繼續開(kāi)發(fā)需要解決肝細胞遞送、脫靶效應等挑戰，然而，目前這是唯一一種在組織中讓cccDNA永久性失活的方法。

       靶向病毒基因表達

       高病毒抗原負荷被認為在維持慢性感染中起到重要作用，因此，通過(guò)沉默cccDNA的轉錄或者降解病毒RNA來(lái)降低病毒抗原的表達水平也獲得研究人員的關(guān)注。

       基于核苷酸的抗HBV療法使用RNA干擾或反義寡核苷酸（ASO）來(lái)降低HBV mRNA的水平。業(yè)界的普遍觀(guān)點(diǎn)是靶向HBV mRNA是治愈性療法的重要組成部分。它可以限制HBsAg的表達，從而幫助HBV特異性免疫力的恢復。這一技術(shù)平臺的另一個(gè)特點(diǎn)是可以通過(guò)對靶點(diǎn)序列的篩選，設計出同時(shí)靶向多種HBV mRNA的療法。

       ▲RNAi療法靶向病毒mRNA的示意圖（圖片來(lái)源：參考資料[3]）

       Arrowhead公司開(kāi)發(fā)的RNAi療法ARC-520在臨床試驗中的表現展現了這類(lèi)療法的潛力。如今的第二代HBV RNAi療法已經(jīng)在臨床試驗中表現出可喜的療效。例如JNJ3989（ARO-HBV）能夠將HBsAg蛋白水平平均降低1.7-2.0 log。

       ASO療法通過(guò)RNase H降解靶點(diǎn)RNA序列，與RNAi療法類(lèi)似，它需要多個(gè)ASOs來(lái)應對不同患者之間出現的序列變異。Ionis Pharmaceuticals公司開(kāi)發(fā)的兩款ASO療法在臨床2期試驗中也獲得了可喜的結果。日前葛蘭素史克（GSK）公司決定獲取這兩款療法的后續開(kāi)發(fā)和推廣權益。

       在治愈性潛力方面，我們目前還不了解需要將HBsAg水平降到多低，維持多久，才能夠導致HBV特異性免疫力的恢復。目前正在進(jìn)行的2期臨床試驗可能為回答這些問(wèn)題提供洞見(jiàn)。可能在降低HBsAg水平之后，我們需要另一種免疫刺激手段來(lái)完全發(fā)揮抗病毒免疫反應的潛力。

       靶向衣殼組裝步驟

       將衣殼組裝抑制劑與NUC聯(lián)用可能進(jìn)一步降低病毒水平，從而在慢性乙肝患者中提高HBV特異性免疫反應的恢復。目前抑制衣殼組裝的小分子藥物可以分為兩類(lèi)：核蛋白異構調節劑（CpAMs）可以導致非衣殼核蛋白多聚體的組裝錯誤（例如GLS4和RO7049389）；衣殼組裝調節劑可以讓衣殼正常組裝，但是不包含病毒核苷酸（例如AT-130， NVR-3778， JNJ6379等）。這兩類(lèi)抑制劑不但可以減少病毒顆粒的釋放，而且可以阻斷核衣殼向細胞核的運輸，從而降低cccDNA的形成。

       圖片來(lái)源：參考資料[4]

       在短期臨床試驗中（小于12個(gè)月），衣殼組裝抑制劑能夠降低HBV的DNA和RNA水平。例如，在施藥期結束之后，NVR-3778能夠讓HBV的DNA水平降低1.72 log，JNJ6379的表現為2.16-2.89 log。

       靶向HBsAg的釋放

       核酸聚合物（nucleic acid polymers, NAPs）由于其兩性聚合物（amphipathic polymers）的特性，可以產(chǎn)生抗病毒作用。它們對HBV感染的特殊作用在于能夠抑制受到感染的肝細胞釋放HBsAg。近來(lái)的臨床試驗表明，Replicor公司開(kāi)發(fā)的REP2139（一種核酸聚合物），和富馬酸替諾福韋二吡呋酯（TDF）和聚乙二醇化干擾素α2a（peg-IFN）聯(lián)用，能夠達到對80%的HBV感染患者的“功能性控制”。

       免疫調節療法

       協(xié)同激活人體的抗病毒免疫力可能導致HBV的功能性治愈。HBV受到控制的患者表現出協(xié)調的HBV特異性激素和細胞免疫反應。他們針對不同的病毒抗原產(chǎn)生強勁的T細胞反應，并且B細胞能夠分泌抗HBV抗體。因此，激活免疫機制讓人體自發(fā)清除HBV感染，可能成為治療慢性HBV感染的一種治療手段。

       靶向先天免疫力的治療策略

       靶向先天免疫力的療法主要利用細胞因子（TNF，IFNα，IFNγ和IL-1β）的抗病毒效應，它們同時(shí)能夠誘發(fā)適應性免疫力。IFNα就是基于這一原理。IFNα療法能夠在5-10%的慢性乙肝患者中達到功能性治愈。這一療法的作用機理在于IFNα不但具有直接抗病毒效果，而且可以提高自然殺傷（NK）細胞的反應。而且，接受IFNα治療后達到HBsAg陰性的患者恢復了HBV特異性T細胞反應。

       抗病毒細胞因子還有可能清除cccDNA，這是治愈慢性乙肝患者最直接和有效的方法。體外研究表明，IFNα或淋巴毒素-β（lymphotoxin-β）可能誘發(fā)對病毒DNA的APOBEC依賴(lài)性脫氨基作用。這可能降低受到感染的肝細胞中的cccDNA水平。

       在慢性乙肝患者中激活先天免疫力還可以通過(guò)Toll樣受體（TLR）或RIG-I激動(dòng)劑來(lái)實(shí)現。RIG-I激動(dòng)劑能夠在肝細胞中直接激活先天免疫力，而TLR7或TLR8激動(dòng)劑能夠激活肝細胞周?chē)拿庖呒毎Ｃ麨閕narigivir的RIG-I激動(dòng)劑同時(shí)具有直接抗病毒效應。在臨床試驗中，它能夠劑量依賴(lài)性降低HBV的DNA和RNA水平，而且26%的患者HBsAg水平出現下降。

       TLR7激動(dòng)劑GS-9620能夠在漿細胞樣樹(shù)突狀細胞（plasmacytoid dendritic cells）中激活I(lǐng)FNα的生成。TLR8激動(dòng)劑能夠強力激活肝內單核細胞和樹(shù)突狀細胞生成和分泌IL-12和IL-18。而IL-12和IL-18會(huì )激發(fā)IFNα的生成，而且IL-12可以部分恢復耗竭HBV特異性T細胞的活性。

       靶向適應性免疫力的策略

       HBV特異性免疫反應在慢性乙肝患者中出現缺陷。理論上這一缺陷可以通過(guò)免疫檢查點(diǎn)抑制劑（例如抗PD-1或抗CTLA-4療法）或治療性**來(lái)解決。抗PD-1療法在慢性乙肝患者中顯示出一致但是有限的抗病毒活性，然而研究人員仍然需要確定篩選患者的標準和抗PD-1療法的劑量。治療性**目前尚未取得顯著(zhù)療效。

       這些免疫療法療效不佳的原因可能與慢性乙肝患者的抗HBV免疫反應相關(guān)。在慢性患者中，HBV特異性T細胞非常稀少，而且顯示出耗竭表型。而且，阻斷PD-1信號通路可能要與其它細胞因子療法聯(lián)用才能夠讓HBV特異性B細胞恢復活性。

       利用基因工程，生成靶向HBV的TCR-T細胞療法或者CAR-T療法可以幫助克服這一障礙。這類(lèi)療法在體外和動(dòng)物試驗中能夠識別HBV感染的靶標。然而，因為制造T細胞療法的過(guò)程非常復雜，這限制了臨床試驗的進(jìn)展。

       展望未來(lái)

       業(yè)界逐漸達成的共識是：我們需要具有創(chuàng )新作用機制的組合療法才能達到功能性治愈的目標。這些療法需要達到以下目標：完全抑制病毒生產(chǎn)和從頭感染（de novo infection）；完全抑制HBsAg的產(chǎn)生；適當激活免疫系統，提高HBV特異性適應性免疫反應；在肝 臟中安全控制免疫反應的強度。

       在設計檢驗組合療法的臨床試驗時(shí)，我們需要具有堅實(shí)的科學(xué)基礎，在臨床前階段了解不同療法的潛在重疊毒副作用，從而在臨床試驗中及時(shí)評估負面反應和潛在藥物相互作用。

       在科研人員的不懈努力之下，我們期待早日克服功能性治愈慢性乙肝患者需要面對的挑戰，為世界各地的患者造福。

       參考資料：

       [1] Fanning et al., (2019). Therapeutic strategies for hepatitis B virus infection: towards a cure. Nature Reviews Drug Discovery. https://doi.org/10.1038/s41573-019-0037-0

       [2] Nassal., (2015). HBV cccDNA: viral persistence reservoir and key obstacle for a cure of chronic hepatitis B. BMJ Gut, http://dx.doi.org/10.1136/gutjnl-2015-309809

       [3] RNAi: Pulling Us Toward Finite Therapy. Retrieved August 28, 2019, from http://ir.arrowheadpharma.com/static-files/d6073d43-ba9d-4f8e-b68e-9ba990e59375

       [4] HBV Treatment Pipeline: Prospects for a CureRetrieved August 28, 2019, from http://media.mycme.com/documents/304/17_peters_final_75913.pdf