“活下來(lái)，就仍然擁有希望！”這是一名杜興氏肌營(yíng)養不良癥（DMD）患者說(shuō)過(guò)的話(huà)。

       DMD是由于在X染色體上編碼抗肌萎縮蛋白的基因上出現突變而導致的罕見(jiàn)遺傳病。抗肌萎縮蛋白的缺失或缺陷，導致肌肉在收縮過(guò)程中出現慢性損傷，炎癥發(fā)作，影響肌肉的再生。最終，肌肉被瘢痕組織或者脂肪代替。患者的肌無(wú)力癥狀在2-3歲時(shí)就很明顯，隨著(zhù)肌肉組織和功能的不斷丟失，在12歲時(shí)通常只能靠輪椅行動(dòng)，20歲時(shí)需要輔助呼吸，在30-40歲時(shí)因為呼吸或心力衰竭而早夭。

       目前，大部分現有療法只能緩解疾病癥狀，卻不能針對疾病根源，DMD患者的希望在于創(chuàng )新療法的開(kāi)發(fā)。而今天的新聞卻不是那么令人喜悅——開(kāi)發(fā)DMD創(chuàng )新療法的Sarepta Therapeutics公司宣布收到了FDA對其DMD療法golodirsen的完整回復信（CRL）。由于對與靜脈輸液接口（intravenous infusion ports）相關(guān)的感染和golodirsen在臨床前動(dòng)物模型中表現出的腎 臟**的疑慮，FDA沒(méi)有加速批準golodirsen上市。

       除了golodirsen以外，多家公司和研究機構也在針對DMD發(fā)病的根本原因——抗肌萎縮蛋白的缺失，開(kāi)發(fā)創(chuàng )新療法。下面，我們來(lái)看一看這些療法的最新進(jìn)展。

       ▲治療DMD的外顯子跳躍和基因組編輯療法（圖片來(lái)源：參考資料[4]）

       外顯子跳躍療法

       外顯子跳躍療法通過(guò)使用RNA或者DNA片段，讓表達抗肌萎縮蛋白的RNA前體在剪接時(shí)跳過(guò)特定外顯子。因為DMD患者的基因突變會(huì )造成閱讀框（reading frame）移動(dòng)，從而生成沒(méi)有功能的抗肌萎縮蛋白。而外顯子跳躍療法去除了基因突變帶來(lái)的閱讀框移動(dòng)，生成的抗肌萎縮蛋白雖然比正常蛋白短一些，但是仍然具有抗肌萎縮蛋白的部分功能。Sarepta公司的golodirsen就是一款外顯子跳躍療法，該公司開(kāi)發(fā)的eteplirsen已經(jīng)獲得FDA批準上市。

       除了Sarepta以外，Wave Life Sciences，第一三共（Daiichi Sankyo），和NS Pharma都在開(kāi)發(fā)不同的外顯子跳躍療法。其中Sarepta公司的casimersen和NS Pharma公司的viltolarsen有望今年遞交監管申請。

       外顯子跳躍療法的局限性在于它是針對抗肌萎縮蛋白基因上特定基因突變而開(kāi)發(fā)的療法。因此，只有在這些區域出現基因突變的DMD患者才適合使用這些療法。而且，目前外顯子跳躍療法生成的抗肌萎縮蛋白水平并不是很高，以golodirsen為例，雖然接受治療的DMD患者抗肌萎縮蛋白表的水平是基線(xiàn)的16倍，但是也只達到正常水平的1%左右。提高外顯子跳躍療法生成的抗肌萎縮蛋白水平是提高這一療法療效的關(guān)鍵。

       因為DMD患者全身的肌肉組織都需要接受治療，因此外顯子跳躍療法需要通過(guò)全身性給藥的方式對患者進(jìn)行治療。目前這一領(lǐng)域的研發(fā)重心之一是如何提高輸入到患者體內的RNA/DNA片段靶向遞送到肌肉的能力。以Sarepta公司的SRP-5051為例，這款外顯子跳躍療法在已經(jīng)獲批的eteplirsen上面偶聯(lián)了靶向肌肉組織的多肽，從而提高了eteplirsen向肌肉組織遞送的能力。

       基因療法

       另一類(lèi)提高抗肌萎縮蛋白水平的療法是基因療法。這種方法將表達抗肌萎縮蛋白的轉基因包裝在A(yíng)AV病毒載體中，然后將這些病毒注入患者體內。它們通過(guò)轉染患者的肌肉細胞，讓肌肉生成具有部分抗肌萎縮蛋白功能的重組蛋白。基因療法的優(yōu)勢在于，它可以對攜帶任何類(lèi)型DMD基因突變的患者生效。以AAV病毒作為載體的基因療法高效轉染肌肉組織的能力已經(jīng)得到了證實(shí)。而且，基因療法理論上可以讓患者接受一次治療之后，獲得長(cháng)期持久的改善，而上面提到的外顯子跳躍療法需要患者長(cháng)期不斷接受治療。

       然而，DMD基因是人類(lèi)基因組中的基因之一，而遞送基因療法的AAV病毒載體能夠容納的基因長(cháng)度有限，因此，目前包裝進(jìn)入AAV載體的DMD轉基因通常編碼的是稱(chēng)為“微抗肌萎縮蛋白”的精簡(jiǎn)版抗肌萎縮蛋白。這種重組蛋白保留了抗肌萎縮蛋白最關(guān)鍵的N端和C端蛋白結合域，但是刪除了蛋白中間的大量血影蛋白樣重復（spectrin-like repeats）。微抗肌萎縮蛋白只能彌補全長(cháng)抗肌萎縮蛋白的部分功能。

       ▲全長(cháng)抗肌萎縮蛋白（a）和基因療法表達的幾種微抗肌萎縮蛋白（b）（圖片來(lái)源：參考資料[4]）

       基于A(yíng)AV載體的基因療法需要面對的另一個(gè)挑戰是很多患者體內已經(jīng)存在對AAV病毒載體的免疫力。這會(huì )導致基因療法還未能生效，就被患者自身的免疫系統清除。而且，在接受基因療法后患者體內也會(huì )產(chǎn)生免疫反應，這意味著(zhù)如果基因療法在幾年后失效，他們無(wú)法再度接受同一療法的治療。這是所有基于A(yíng)AV載體的基因療法需要解決的挑戰。

       目前，Sarepta公司的研發(fā)管線(xiàn)中也有一款名為SRP-9001的基因療法。這一療法使用的是從非人靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物中分離出的AAVrh74載體，它的優(yōu)點(diǎn)是能夠在肌肉中引起轉基因的強力表達，不會(huì )穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統。而且，較少患者體內存在針對這一病毒載體的免疫力。SRP-9001基因療法由MHCK7啟動(dòng)子驅動(dòng)轉基因的表達。這款啟動(dòng)子不但能夠在骨骼肌、心肌和膈肌中驅動(dòng)轉基因表達，而且尤其增強了轉基因在心臟中的表達。

       除了Sarepta公司以外，輝瑞（Pfizer）公司最近公布了基于A(yíng)AV9病毒載體的DMD基因療法的1b期臨床試驗結果，并且計劃在2020年開(kāi)展3期臨床試驗。而Solid Biosciences公司的DMD基因療法SGT-001最近也獲得FDA放行，繼續進(jìn)行臨床試驗。

       基因組編輯療法

       多家學(xué)術(shù)研究機構已經(jīng)使用基于CRISPR的基因編輯技術(shù)，開(kāi)發(fā)治療DMD的基因編輯療法。這類(lèi)療法目前還處于臨床前實(shí)驗階段。它與外顯子跳躍療法有些類(lèi)似，利用CRISPR基因編輯技術(shù)在患者DMD基因上切除包含基因突變的特定外顯子，從而消除基因突變對抗肌萎縮蛋白生成的影響。與外顯子跳躍療法相比，它的優(yōu)勢在于永久性改變了患者DMD基因的結構，因此理論上只需要一次治療，就可以讓患者終身受益。今年杜克大學(xué)（Duke）研究團隊在Nature Medicine雜志上發(fā)表的研究表明，在小鼠模型中，治療DMD的基因編輯療法在一年之后仍然可以維持表達抗肌萎縮蛋白的效果。

       基因組編輯療法同樣需要使用AAV病毒載體遞送，因此同樣需要克服對AAV病毒載體的免疫力的挑戰。而基因組編輯療法面對的獨特挑戰在于CRISPR基因編輯系統的“脫靶效應”。由于DMD患者需要接受全身性療法，避免CRISPR基因編輯系統的“脫靶效應”變得非常關(guān)鍵。

       通讀終止密碼子（Stop Codon Readthrough）療法

       在大約13%的DMD患者中，基因突變導致終止密碼子的出現，這種基因突變不會(huì )造成閱讀框的改變，而是導致蛋白合成過(guò)早終止，生成沒(méi)有功能的抗肌萎縮蛋白。

       有些化合物通過(guò)與終止密碼子相結合，可以讓負責轉譯RNA的核糖體在讀到終止密碼子的地方添加一個(gè)氨基酸，而不是停止轉譯過(guò)程。通過(guò)高通量篩選發(fā)現的ataluren在動(dòng)物實(shí)驗中能夠提高抗肌萎縮蛋白表達水平，并且具有相對良好的安全性和耐受性。這款藥物已經(jīng)在2014年獲得歐盟有條件批準，商品名為T(mén)ranslarna。然而，在隨后進(jìn)行的驗證性3期臨床試驗中，ataluren沒(méi)有達到試驗的主要終點(diǎn)。目前，ataluren在新的驗證性3期臨床試驗中接受檢驗。

       通讀終止密碼子療法的局限性在于，它只能治療產(chǎn)生終止密碼子的DMD基因突變。

       結語(yǔ)

       在收到FDA的CRL之后，Sarepta公司總裁兼首席執行官Doug Ingram先生表示，將盡快與FDA會(huì )晤，全面解決CRL中提出的疑慮，并且尋找盡快批準golodirsen上市的監管通路，因為：

       “患者們等不及了！”

       誠然，開(kāi)發(fā)有效DMD療法的道路上挑戰眾多，挫折在所難免，我們期待研發(fā)人員能夠砥礪前行，早日將患者們期盼的希望交到他們手中。

       參考資料：

       [1] Sarepta Therapeutics Receives Complete Response Letter from the US Food and Drug Administration for Golodirsen New Drug Application. Retrieved August 19, 2019, from https://investorrelations.sarepta.com/news-releases/news-release-details/sarepta-therapeutics-receives-complete-response-letter-us-food

       [2] Sarepta Announces FDA Acceptance of Golodirsen (SRP-4053) New Drug Application for Patients with Duchenne Muscular Dystrophy Amenable to Skipping Exon 53. Retrieved August 15, 2019, from https://investorrelations.sarepta.com/news-releases/news-release-details/sarepta-announces-fda-acceptance-golodirsen-srp-4053-new-drug

       [3] SAREPTA 2019 PPMD ANNUAL CONFERENCE PRESENTATION (RNA therapy). Retrieved August 19, 2019, from https://investorrelations.sarepta.com/static-files/33df8d49-8c3d-4a88-8717-12723b4a0750

       [4] Verhaart and Artsma-Rus. (2019). Therapeutic developments for Duchenne muscular dystrophy. Nature Reviews Neurology, https://doi.org/10.1038/s41582-019-0203-3

       [5] SAREPTA 2019 PPMD ANNUAL CONFERENCE PRESENTATION (gene therapy). Retrieved August 19, 2019, from https://investorrelations.sarepta.com/static-files/99d3a9d7-df9a-45dc-922a-4e6a7c6f0e41

       [6] Nelson et al., (2019). Long-term evaluation of AAV-CRISPR genome editing for Duchenne muscular dystrophy. Nature Medicine, https://doi.org/10.1038/s41591-019-0344-3.

       [6] SAREPTA 2019 PPMD ANNUAL CONFERENCE PRESENTATION (gene therapy). Retrieved August 19, 2019, from https://investorrelations.sarepta.com/static-files/99d3a9d7-df9a-45dc-922a-4e6a7c6f0e41