基因療法能夠為傳統治療手段無(wú)法觸及的疾病提供治療選擇！自2016年以來(lái)，歐盟EMA和美國FDA已經(jīng)批準了6款基因療法產(chǎn)品，其中包括治療B細胞血癌的兩款CAR-T細胞療法，和四款治療嚴重單基因遺傳病的基因療法。今年，美國FDA和歐盟EMA分別批準了諾華（Novartis）治療脊髓性肌肉萎縮（SMA）的Zolgensma和bluebird bio治療β地中海貧血的Zynteglo。如今，超過(guò)800個(gè)細胞和基因療法項目處于臨床開(kāi)發(fā)階段，可以預見(jiàn)更多細胞和基因療法將獲批上市。近日，著(zhù)名醫學(xué)期刊《新英格蘭醫學(xué)雜志》（NEJM）上的一篇綜述對這一領(lǐng)域的現狀和未來(lái)進(jìn)行了盤(pán)點(diǎn)，藥明康德內容團隊今天將與讀者們分享這一綜述的精彩內容。

       基因療法的基本原理

       治療遺傳病的基因療法的目標是：持續表達治療性基因或轉基因，維持足夠水平的基因表達，從而在緩解或治愈疾病癥狀的同時(shí)，將副作用降至最小。目前有兩種基本策略：一是使用整合性載體，將轉基因導入干細胞或祖細胞中，讓轉基因可以傳遞到每個(gè)后代細胞中；二是使用非整合性載體，將轉基因遞送到長(cháng)期存活的細胞中（它們可能不再分裂或者分裂非常緩慢），確保轉基因能夠在細胞中長(cháng)期表達。對干細胞的轉導通常離體（ex vivo）進(jìn)行，需要使用整合型載體，而向長(cháng)期存活的細胞中遞送基因療法通常使用體內（in vivo）基因遞送手段。

       使用離體轉導策略，研究人員需要從患者身上獲取細胞，導入治療性基因，然后利用與造血干細胞移植類(lèi)似的方法將這些改造過(guò)的細胞輸回患者體內。這一策略需要遞送基因的載體、被遞送的基因片段，以及一個(gè)技術(shù)復雜的設施來(lái)處理這些細胞。與之相比，體內基因遞送系統的使用跟其它藥品類(lèi)似，包含轉基因的載體通常被冷凍保存，它可以被藥劑師解凍和準備好，通常門(mén)診手術(shù)就可以完成給藥。

       使用基因療法治療遺傳病需要的不只是發(fā)現致病基因。轉基因需要被遞送到與生理學(xué)相關(guān)的靶點(diǎn)組織或細胞中，它們需要穩定表達，而且必須不會(huì )影響這些細胞的正常功能。

       安全性考量

       ▲基因療法的理論風(fēng)險和觀(guān)察到的臨床風(fēng)險（數據來(lái)源：參考資料[1]，藥明康德內容團隊制圖）

       在獲得與基因療法相關(guān)的臨床數據之前，研究人員已經(jīng)列出了它們潛在的理論風(fēng)險。而臨床數據的產(chǎn)生重新為這些風(fēng)險的重要性進(jìn)行了排序。現在我們知道，整合型載體（例如逆轉錄病毒載體）的主要風(fēng)險是插入突變（insertional mutagenesis）——它們可能通過(guò)整合到細胞的DNA中，擾亂DNA上原有基因的功能。對于體內遞送基因療法的載體，主要風(fēng)險來(lái)自對載體的免疫反應。

       對于插入突變，降低這一風(fēng)險的主要方法是設計更安全的病毒載體（例如慢病毒載體）。而免疫反應的風(fēng)險可以通過(guò)使用輔助性免疫調節藥物來(lái)控制。前期研究的失敗和意外不良事件的經(jīng)驗對這些優(yōu)化措施的開(kāi)發(fā)作出了重要的指導。

       離體基因療法

       ▲離體基因療法示意圖（圖片來(lái)源：Boston Children's Hospital官網(wǎng)）

       治療嚴重聯(lián)合免疫缺陷（SCID）——我們學(xué)到了什么？

       在2016年，基于造血干細胞和祖細胞（HSPCs）的離體基因療法達到了一個(gè)里程碑。EMA批準Orchard Therapeutis公司的Strimvelis上市，治療腺苷脫氨酶（ADA）缺失導致的嚴重聯(lián)合免疫缺陷。這一療法使用γ-逆轉錄病毒載體，將正常的ADA基因導入患者自身的HSPCs中，然后輸回患者體內。

       20多年前，第一項使用γ-逆轉錄病毒載體治療ADA缺失性嚴重聯(lián)合免疫缺陷的研究沒(méi)有獲得成功，因為輸回患者體內后，定植在體內的HSPCs數量不足。近10年來(lái)的研究發(fā)現，想要維持長(cháng)久的ADA蛋白表達，需要在移植HSPCs之前，使用低劑量的白消安（busulfan）來(lái)殺死骨髓中原有的骨髓細胞，這可以為基因工程改造過(guò)的HSPCs留出空間，提高它們的定植水平。不幸的是，消除骨髓細胞的化療手段具有毒性，可能提高繼發(fā)性腫瘤產(chǎn)生的風(fēng)險，或者導致骨髓衰竭。目前，研究人員正在探索其它消除骨髓細胞的方法，其中包括基于抗體的消除手段。

       早期臨床試驗發(fā)現的另一個(gè)問(wèn)題是γ-逆轉錄病毒載體在某些患者中可能引起T細胞淋巴癌，導致他們需要接受高劑量化療和骨髓移植，這一嚴重副作用促使研究人員尋找更安全的病毒載體。

       慢病毒整合進(jìn)人類(lèi)基因組的模式比γ-逆轉錄病毒載體更安全。雖然，生產(chǎn)臨床級別的慢病毒載體仍然是一個(gè)挑戰，但是基于慢病毒的離體基因療法策略目前在多項臨床試驗中治療免疫缺陷、代謝疾病和遺傳性血液病。

       治療地中海貧血和鐮狀細胞貧血癥

       治療β-地中海貧血和鐮狀細胞貧血癥的基因療法在經(jīng)過(guò)研究人員30多年的努力后終于見(jiàn)到了曙光。今年EMA批準了bluebird bio開(kāi)發(fā)的Zynteglo，治療12歲以上的輸血依賴(lài)型β-地中海貧血患者（非β0/ β0基因型）。研究表明，基因療法的臨床效力與基因轉導效率、轉導細胞中的病毒拷貝數目、和基因工程改造過(guò)的HSPCs的輸入劑量成正比。目前，有四項基因療法臨床試驗正在進(jìn)行中，使用不同載體靶向不同基因，治療鐮狀細胞貧血癥。

       體內基因療法

       ▲使用AAV載體遞送基因療法的示意圖（圖片來(lái)源：Public Domain）

       體內基因轉導研究將載體直接注射到患者體內，它們被用來(lái)治療多種單基因疾病。AAV載體是大多數研究中使用的載體，它沒(méi)有致病性，而且不會(huì )引起強烈的免疫反應。AAV載體局限性之一是當轉基因序列大于5 kb后，轉基因包裝進(jìn)載體的效率迅速下降。早先的臨床研究發(fā)現人體的免疫反應是阻礙全身性AAV基因療法療效的主要障礙。因為很多人已經(jīng)受到過(guò)野生型AAV的感染，因此體內不但具有靶向AAV的循環(huán)抗體，還有衣殼特異性記憶T細胞。開(kāi)發(fā)繞過(guò)已有抗體的中和效應和控制細胞性免疫反應的方法是推廣AAV臨床應用的關(guān)鍵。

       第一款獲得批準的AAV基因療法是uniQure公司開(kāi)發(fā)的Glybera。它在2012年獲得EMA批準，治療脂蛋白脂肪酶缺乏癥。雖然由于市場(chǎng)需求很低，這款基因療法在2017年退市，然而它的批準表明，基于A(yíng)AV的基因療法能夠滿(mǎn)足監管要求，因此激發(fā)了其它AAV基因療法的開(kāi)發(fā)。

       治療視力喪失

       在2017年12月，FDA批準了Spark Therapeutics公司開(kāi)發(fā)的Luxturna，用于治療由于RPE65基因上的突變導致的罕見(jiàn)失明癥。RPE65基因編碼的蛋白酶對視覺(jué)循環(huán)非常關(guān)鍵。如果不接受治療，這一疾病在多數患者中會(huì )導致完全失明。視網(wǎng)膜是非常適于基因療法的靶點(diǎn)組織，因為它能夠耐受引入的外來(lái)抗原而不會(huì )產(chǎn)生炎癥性免疫反應，而且治療眼科疾病需要的載體數量相對較少。AAV載體可以在門(mén)診手術(shù)中被注射到視網(wǎng)膜下。Luxturna的獲批激發(fā)了使用類(lèi)似策略治療其它類(lèi)型先天性失明疾病的研究。目前有多項臨床試驗治療各種遺傳性視網(wǎng)膜營(yíng)養不良。

       全身性基因療法遞送，治療血友病和免疫反應

       通過(guò)靜脈輸液輸入AAV載體可以靶向肝 臟和其它器官遞送基因療法。早期的臨床試驗試圖使用血管內給藥的方式輸入AAV基因療法，治療嚴重B型血友病患者。這一臨床試驗的結果發(fā)現了兩大免疫學(xué)障礙：20-40%患者體內已經(jīng)存在靶向AAV的抗體，它們會(huì )中和載體，降低療效；人體在接受載體輸入4-12周之后，會(huì )產(chǎn)生針對AAV衣殼的延遲免疫反應。這一免疫反應會(huì )攻擊已經(jīng)被轉導的細胞，導致療效消失。

       這兩大問(wèn)題的原因都是人體曾經(jīng)受到過(guò)野生型AAV的感染，導致體內存在靶向抗體和記憶T細胞。

       針對體內已有抗體的短期解決辦法是將攜帶已有抗體的患者排除在治療范圍之外，顯然我們需要更好的方法。目前克服這一障礙的策略包括：使用不常見(jiàn)的AAV亞型，人工生成嵌合型AAV或修改AAV衣殼上引發(fā)免疫反應的蛋白抗原。

       ▲改進(jìn)AAV載體衣殼蛋白的策略（圖片來(lái)源：參考資料[2]）

       延遲免疫反應的臨床表現為轉氨酶水平升高，后續研究表明外周血中的單核細胞在識別與AAV衣殼相關(guān)的多肽片段后會(huì )分泌干擾素γ。這會(huì )導致轉基因表達的凝血因子IX蛋白水平逐漸下降，直至完全消失。

       這一發(fā)現意味著(zhù)如果對免疫系統暫時(shí)進(jìn)行藥理學(xué)抑制，可能幫助維持基因療法的療效，因為衣殼蛋白相關(guān)多肽片段只會(huì )在體內暫時(shí)出現。這一假說(shuō)在后續臨床試驗中得到驗證，參加臨床試驗的患者在出現轉氨酶升高或凝血因子IX水平下降時(shí)，接受糖皮質(zhì)激素的治療。這導致了基因療法療效的顯著(zhù)增強。

       降低免疫反應的另一個(gè)方法是使用具有超出野生型活性的凝血因子IX變體。這可以讓患者在接受更少劑量基因療法（劑量是先前療法的四分之一）的情況下，維持更高的平均因子IX活性水平。因為免疫反應的強度與輸入AAV載體的劑量相關(guān)，減少AAV基因療法的劑量在后續臨床試驗中引發(fā)免疫反應的頻率也有所下降。

       在治療A型血友病方面，因為編碼凝血因子VIII的基因很大，所以將具有正常功能的轉基因裝入AAV載體是一個(gè)需要克服的挑戰。目前臨床試驗中使用的基因療法表達的是一款“精簡(jiǎn)版”因子VIII。BioMarin公司開(kāi)發(fā)的Valoctocogene roxaparvovec已經(jīng)在3期臨床試驗中獲得積極結果，并且在長(cháng)達3年的隨訪(fǎng)時(shí)間中顯著(zhù)降低了患者的年出血率和因子VIII使用率。該公司計劃在今年第四季度遞交監管申請。

       治療脊髓性肌肉萎縮

       全身性AAV基因療法的另一個(gè)成功案例是諾華公司（Novartis）今年獲批治療脊髓性肌肉萎縮（SMA）的Zolgensma。SMA是由于編碼運動(dòng)神經(jīng)元生存蛋白的SMN1基因出現突變而導致的罕見(jiàn)遺傳病。根據發(fā)病的時(shí)間和嚴重程度，它可以分為四種亞型。1型SMA是導致嬰兒死亡的最常見(jiàn)遺傳因素，患者死亡或需要持續呼吸輔助的中位年齡為10.5個(gè)月。Zolgensma的臨床試驗已經(jīng)擴展到超過(guò)100名嬰幼兒。試驗結果與最初的臨床結果一致。

       基因療法的機遇和挑戰

       在監管方面的兩個(gè)最新動(dòng)向將支持基因療法作為治療模式的進(jìn)一步成熟。第一個(gè)動(dòng)向是美國國立衛生研究院（NIH）主任Francis Collins博士和前FDA局長(cháng)Scott Gottlieb博士宣布，FDA將完全負責對基因療法進(jìn)行審評。此前，基因療法需要經(jīng)過(guò)NIH重組DNA咨詢(xún)委員會(huì )和FDA的雙重審評。這一變化有助于簡(jiǎn)化基因療法的審評程序。

       另一個(gè)動(dòng)向是FDA組織和先進(jìn)療法辦公室（Office of Tissue and Advanced Therapies）在2018年發(fā)布了6個(gè)新的指導文件，根據這一領(lǐng)域的經(jīng)驗和共識，對使用基因療法治療多種疾病在臨床前、臨床期研究和生產(chǎn)方面提出了標準化的指導和建議。

       基因療法的成本是可能阻礙它獲得廣泛推廣的一個(gè)重要因素。以前的醫療保險體系的設計是針對需要長(cháng)期服用的藥物類(lèi)型，對于所有細胞和基因療法來(lái)說(shuō)，如何將這種“一次性”治療，但是可能帶來(lái)長(cháng)期療效的治療模式融入醫療保險體系是一個(gè)重要的挑戰。

       大多數人同意，如果療效相當，一次治療的模式要優(yōu)于必須重復使用的藥物。因此，一次性療法帶來(lái)的長(cháng)遠利益將證明高成本療法的價(jià)值。血友病就是一個(gè)很好的例子，目前，治療血友病的標準療法是凝血因子替代療法，這種療法不但需要患者每周接受3-4次輸液治療，而且每年每位患者的治療成本高達40萬(wàn)美元以上。治療血友病的新基因療法長(cháng)遠來(lái)看，可能為醫療保健系統節省資源。

       然而，對于以前沒(méi)有任何治療方法的疾病來(lái)說(shuō)，如何支付創(chuàng )新療法的費用仍然需要被解決。目前藥物開(kāi)發(fā)公司也在對多種付費模式進(jìn)行探索，包括根據治療效果付費，以及在治療效果得到維持的情況下分期付費。

       對于離體基因療法來(lái)說(shuō)，未來(lái)的目標是：

       1、優(yōu)化慢病毒載體的設計，進(jìn)一步提高安全性和對轉基因的控制。

       2、有效地大規模生產(chǎn)載體并對它們進(jìn)行分析評估。

       3、開(kāi)發(fā)毒性更小的前期處理療法，在提高基因工程改造后的干細胞定植水平的同時(shí)，減少并發(fā)癥的產(chǎn)生。

       對于使用AAV載體的體內基因療法來(lái)說(shuō)，下一個(gè)十年里專(zhuān)注的問(wèn)題是：

       1、進(jìn)一步澄清和控制人體對病毒載體的免疫反應。

       2、改進(jìn)AAV載體設計，在改善靶向遞送基因療法能力的同時(shí)，降低需要的療法劑量，提高體內療效。

       總體來(lái)看，基因療法領(lǐng)域的進(jìn)步已經(jīng)為很多以前無(wú)法治愈的疾病提供了令人興奮的新治療機會(huì )。我們期待在醫藥產(chǎn)業(yè)不同成員的協(xié)作努力之下，這一新的治療模式能夠克服現有的挑戰，發(fā)揮它全部的治療潛力！

       參考資料：

       [1] High and Roncarolo, (2019). Gene Therapy. The New England Journal of Medicine, DOI: 10.1056/NEJMra1706910.

       [2] Wang et al, (2019). Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. https://doi.org/10.1038/s41573-019-0012-9