大規(guī)模隱性遺傳篩查是一種用于鑒定生物過(guò)程基因的有效方法。這種策略在低等生物中已經(jīng)成功，如酵母（釀酒酵母）和線蟲（秀麗隱桿線蟲）。在哺乳動(dòng)物生物中，由于它們的二倍體基因組，這種功能篩選具有挑戰(zhàn)性。RNA干擾（RNAi）目前用于通過(guò)靶向mRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行基因組規(guī)模的功能喪失篩選;然而，這種方法通常不足以抑制基因表達(dá)，并對(duì)其他mRNA具有脫靶效應(yīng)。CRISPR-Cas9系統(tǒng)已經(jīng)應(yīng)用于小鼠和人細(xì)胞中的有效功能喪失篩選。然而，迄今為止，CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組規(guī)模篩選僅在細(xì)胞水平上使用，限制了其應(yīng)用于基于細(xì)胞的表型。
從單性生殖或雄激素胚泡中產(chǎn)生哺乳動(dòng)物單倍體胚胎干細(xì)胞（haESCs）為細(xì)胞水平的遺傳分析提供了理想的工具。雄激素haESCs（AG-haESCs），其基因組來(lái)自精子，支持胚胎注射到成熟卵母細(xì)胞，活體動(dòng)物被稱為半克隆（SC）動(dòng)物。此外，攜帶組成型表達(dá)的Cas9和單指導(dǎo)RNA（sgRNA）文庫(kù)的DKO-AG-haESCs允許一步產(chǎn)生突變小鼠，顯示在小鼠的生物體水平上進(jìn)行功能性誘變篩選的可能性。
2019年7月2日，中科院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）李勁松聯(lián)合鄒衛(wèi)國(guó)團(tuán)隊(duì)等人在PLOS Biology上發(fā)表題為“Targeted genetic screening in mice throughhaploid embryonic stem cells identifies critical genes in bone development”的文章，建立了一種體內(nèi)遺傳篩選策略，以基于ICAHCI技術(shù)和CRISPR-Cas9文庫(kù)的組合應(yīng)用來(lái)鑒定參與骨發(fā)育的基因。
研究人員使用Cas9B-3-BD細(xì)胞進(jìn)行ICAHCI實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)生突變小鼠。試圖通過(guò)骨骼分析來(lái)識(shí)別骨骼發(fā)育中涉及的關(guān)鍵基因，這些新生SC幼崽可能覆蓋69個(gè)候選基因。為了測(cè)試來(lái)自Cas9B-3-BD細(xì)胞的所得SC幼崽中的突變率，研究人員分析了3個(gè)ICAHCI實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的總共39個(gè)SC幼崽。sgRNA插入分析表明38只幼崽攜帶1個(gè)sgRNA。
Sanger測(cè)序的常規(guī)基因分型分析顯示其中29個(gè)在sgRNA靶向位點(diǎn)攜帶突變，其中21個(gè)攜帶純合或雙等位基因突變，效率為55.3％，顯著高于先前報(bào)道的效率30.5％（83/272）。 TIDE或胸腺嘧啶和腺嘌呤（TA）克隆分析顯示，21個(gè)純合子或雙等位基因突變小鼠中有13個(gè)攜帶框內(nèi)突變/野生型序列，總序列少于30％。同時(shí)，TIDE結(jié)果顯示12只SC幼崽攜帶超過(guò)2種類型的等位基因，與在Runx2被靶向時(shí)的早期觀察結(jié)果一致。總之，這些結(jié)果表明，使用具有靶向sgRNA文庫(kù)并組成型表達(dá)Cas9的Cas9B-3-BD細(xì)胞，可以通過(guò)ICAHCI有效地產(chǎn)生突變小鼠。
通過(guò)產(chǎn)生突變小鼠系驗(yàn)證Rln1和Irx5
誘變篩選對(duì)于鑒定參與發(fā)育過(guò)程的關(guān)鍵基因是有效的。然而，這種篩選僅在低等生物中成功。該研究通過(guò)結(jié)合雄激素單倍體胚胎干細(xì)胞（AG-haESCs）和CRISPR-Cas9技術(shù)，在小鼠中開(kāi)發(fā)靶向遺傳篩選方法。通過(guò)卵母細(xì)胞注射攜帶組成型表達(dá)的Cas9的AG-haESCs和指導(dǎo)72個(gè)預(yù)選基因的單指導(dǎo)RNA（sgRNA）文庫(kù)，通過(guò)骨骼篩選骨發(fā)育相關(guān)基因，制備突變半克?。⊿C）小鼠庫(kù)。發(fā)現(xiàn)了4個(gè)基因：骨骼發(fā)育所需的Zic1和Clec11a，以及之前未考慮過(guò)的Rln1和Irx5。
盡管Rln1 - / - 小鼠僅在出生時(shí)表現(xiàn)出較小的骨骼，但骨量減少和骨髓脂肪生成增加，Irx5 - / - 小鼠在出生后和成人階段都顯示出骨骼異常。IRX5通過(guò)抑制過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）活化來(lái)促進(jìn)成骨細(xì)胞生成并抑制脂肪形成。因此，AG-haESC介導(dǎo)的功能性誘變篩選為小鼠發(fā)育過(guò)程的遺傳查詢開(kāi)辟了新的途徑。
合作咨詢
肖女士
021-33392297
Kelly.Xiao@imsinoexpo.com
2006-2025 上海博華國(guó)際展覽有限公司版權(quán)所有（保留一切權(quán)利）
滬ICP備05034851號(hào)-57
