時(shí)隔3年，曾處于輿論旋渦的韓春雨公開了一項(xiàng)最新研究成果。
近日，韓春雨在預(yù)印本網(wǎng)站BioRxiv上發(fā)表了一篇關(guān)于基因編輯的新文章：Background free tracking of single RNA in living cells using catalytically inactive CasE。
文章共有5名作者，依次為Feng Gao, Yue Sun, Feng Jiang, Xiaoyue Bai, Chunyu Han，工作單位均為河北科技大學(xué)基因編輯研究中心。其中，韓春雨為通訊作者。
論文中提到的CasE是Ⅰ-E型 CRISPR復(fù)合物的核心成分，它通過結(jié)合特定的莖環(huán)區(qū)域單獨(dú)處理pre-crRNA，稱之為 CasE Binding S，簡稱為CBS。CasE保守His20參與催化活性，ΔHis26-TtCse3突變的CasE（dCasE）則失去了催化活性，但仍然與其靶標(biāo)緊密結(jié)合。
在該研究中，通過將 split 熒光與dCasE的N端和C-末端（ΔHis20）融合，構(gòu)建了活體RNA跟蹤工具VN-dCasE-VC。該系統(tǒng)僅在存在靶RNA時(shí)才發(fā)出熒光，從而增強(qiáng)信噪比。
在活細(xì)胞中進(jìn)行可視化的RNA追蹤，不需要特定的亞細(xì)胞分布。CasE-GFP和dCasE-GFP在HEK293T細(xì)胞中的高水平表達(dá)和均勻分布表明CasE和dCasE適合于活細(xì)胞中的RNA操作。
為了測試CasE在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)是否具有強(qiáng)活性，作者構(gòu)建了“關(guān)閉”報(bào)告基因質(zhì)粒CBS-GFP-N1。它由5′-UTR中的GFP mRNA和CasE結(jié)合位點(diǎn)（CBS）組成。當(dāng)CasE被引入系統(tǒng)時(shí)，GFP表達(dá)水平急劇下降。
同時(shí)，為了進(jìn)一步測試CasE活性，作者還構(gòu)建了“開啟”報(bào)告基因質(zhì)粒RED-16×CBS-Lin28-C1，其中CBS插入RED單體基因的3′-UTR區(qū)和Lin28的上游。Lin28是RNA核保留信號，在其3′-UTR中具有l(wèi)in28信號的RED單體mRNA幾乎不能翻譯成蛋白質(zhì)。
CBS-CasE依賴限制性切斷l(xiāng)in28信號并從核釋放靶mRNA用于翻譯（圖1E和圖1F）。這些表明CasE可以結(jié)合并切割哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的CBS。
另外，為了將dCasE-CBS相互作用設(shè)計(jì)到RNA追蹤系統(tǒng)中，作者通過將split-FP5-7與dCasE蛋白結(jié)合。發(fā)現(xiàn)一個(gè)版本，即VN-dCasE-VC很難發(fā)出熒光，這可能是由于不正確的折疊或不穩(wěn)定的狀態(tài)，但是當(dāng)與靶RNA（CBS）結(jié)合時(shí)，可以在熒光顯微鏡下清楚地捕獲熒光信號，即使VN-dCasE-VC表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染劑量非常低。
接下來，作者使用VN-dCasE-VC系統(tǒng)追蹤哺乳動(dòng)物細(xì)胞中過表達(dá)的β-肌動(dòng)蛋白（β-Actin）的mRNA，VN-dCasE-VC系統(tǒng)在細(xì)胞質(zhì)中顯示出強(qiáng)熒光。此外還觀察到，向靶mRNA添加更多CBS可改善信號，熒光追蹤更清晰，因此，可以通過增加CBS的數(shù)量來檢測低豐度的mRNA。
總的來說，韓春雨團(tuán)隊(duì)發(fā)明了一種新的RNA追蹤工具，將其命名為VN-dCasE-VC，該系統(tǒng)能夠追蹤活細(xì)胞中沒有背景的特定RNA，通過熒光將其可視化。
目前已有兩種活細(xì)胞RNA追蹤成像工具，一種是MS2，一種是Cas13a，韓春雨團(tuán)隊(duì)開發(fā)的dCasE系統(tǒng)，成像效果由于MS2，而且，dCasE蛋白的分子量為22kDa，遠(yuǎn)小于Cas13a的130kDa，dCasE的小分子量更容易遞送至細(xì)胞內(nèi)，因此更適合用于活細(xì)胞的RNA追蹤。
一位接近韓春雨的人士透露：“這篇文章是此前韓春雨工作的延續(xù)，目的都是開發(fā)基因編輯工具。”
不過，值得注意的是，該研究目前發(fā)表于預(yù)印本網(wǎng)站，尚未經(jīng)過同行評議，
對此，有科研人士指出，首發(fā)在未經(jīng)同行評議的預(yù)印本上，是為了獲得首發(fā)權(quán)。“韓春雨下一步還會(huì)投正式期刊的。”前述人士推測。
不知道此次新的研究成果是否會(huì)再次給韓春雨帶來關(guān)注，2016年5月，《自然—生物技術(shù)》發(fā)表韓春雨團(tuán)隊(duì)新的基因編輯技術(shù)NgAgo，被媒體以“甘坐冷板凳、十年憋大招”的故事原型炒作而走紅，此后半年，韓春雨個(gè)人及其所在大學(xué)陸續(xù)獲得各類名譽(yù)和大量經(jīng)費(fèi)資助，但亦有國內(nèi)多名基因編輯領(lǐng)域科學(xué)家實(shí)名發(fā)聲稱實(shí)驗(yàn)結(jié)果難以重復(fù)，懷疑實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性。
2017年8月，《自然—生物技術(shù)》發(fā)表題為《是該數(shù)據(jù)說話的時(shí)候了》社論，宣布撤回韓春雨團(tuán)隊(duì)于2016年5月2日發(fā)表在該期刊的論文。
2018年9月，河北科技大學(xué)發(fā)布公告，韓春雨團(tuán)隊(duì)不存在主觀造假。但依據(jù)有關(guān)規(guī)定，取消韓春雨所獲得的榮譽(yù)稱號，終止韓春雨團(tuán)隊(duì)承擔(dān)的科研項(xiàng)目并收回科研經(jīng)費(fèi)。
韓春雨團(tuán)隊(duì)回應(yīng)稱，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)存在缺陷、研究過程存在著不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膯栴}。
有業(yè)界人士表示：“這波之后，NgAgo這個(gè)研究方向在中國做得很慢。韓春雨他們的工作開展起來也比較困難，連學(xué)生也沒有新招。”
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