SMA是一種常染色體隱性遺傳的神經(jīng)肌肉病，常見(jiàn)于嬰幼兒，主要表現為肌肉萎縮、肌張力低、腱反射減弱等，大部分患兒在不到兩周歲時(shí)死亡，幸存者也會(huì )在成年后喪失大部分運動(dòng)能力，需要在輪椅上生活。反義核苷酸Nusinersen是目前唯一獲批可用于此病的藥物。
人類(lèi)的SMN基因有兩種：SMN 1和SMN 2，兩者都位于5號常染色體，且非常相近，其編碼的SMN蛋白若缺失，會(huì )導致脊髓中的α神經(jīng)元死亡，引起脊髓型肌萎縮。SMN蛋白主要由SMN 1基因表達，當其缺失或突變體純合時(shí)，SMN 2基因能部分抵消其產(chǎn)生的缺陷，但SMN 2基因中一個(gè)堿基異位突變時(shí)，造成其轉錄的mRNA前體在剪接時(shí)容易丟失7號外顯子，因此只能產(chǎn)生10%-20%的正常SMN蛋白，造成SMA。目前對SMA的治療除上述提及的反義核苷酸Nusinersen外，也有通過(guò)基因替換或小分子調節的方式，但都還處于研究中。脊髓性肌萎縮癥在人群中的攜帶率約為1/35-1/50左右，發(fā)病率約為1/6000-1/10000左右。
Hit compound的發(fā)現
由于SMA是一種典型的信使RNA前體剪接異常造成的關(guān)鍵蛋白表達障礙，而mRNA剪接過(guò)程較為復雜，涉及到多個(gè)因素，因此Novartis采用高通量表型篩選技術(shù)，以期能夠得到可調節SMN 2基因RNA剪接的小分子化合物。
在NSC34運動(dòng)神經(jīng)元細胞系中運用Minigene技術(shù)作為篩選方法，對大約1.4ⅹ106個(gè)化合物進(jìn)行篩選，不到1%的化合物有響應，以噠嗪為核心骨架的化合物表現出較好的效果，得到代表性化合物1。化合物在高通量測試條件下，EC50=3.5 μM，相比DMSO的控制組，SMN 2 報告基因信號增強了1700%，在小鼠的SMN ELISA測試中，EC50 = 0.6 μM，SMN蛋白表達水平提高了2.5倍，在人類(lèi)SMA患者的細胞模型中，SMN蛋白表達水平提高了1.5倍，但是該化合物的血漿清除率較高，口服生物利用度也僅有18%，而且還存在hERG抑制活性，因此需要進(jìn)一步的藥物化學(xué)優(yōu)化。
化合物優(yōu)化
在對化合物進(jìn)行藥物化學(xué)優(yōu)化前，分析其結構可知，1以噠嗪環(huán)為中心結構，左側是一個(gè)苯并噻吩的芳環(huán)結構，右側通過(guò)一個(gè)雜原子（胺）與哌 啶環(huán)相連，因此在進(jìn)行優(yōu)化研究時(shí)，可按照上述的分析進(jìn)行優(yōu)化。
在芳環(huán)體系的優(yōu)化中，將CH衍生為N或者變換N的取代位置，常常會(huì )對化合物的活性以及理化性質(zhì)產(chǎn)生非常明顯的效果！早期的噠嗪環(huán)含兩個(gè)鄰位的氮原子，將氮原子變換位置和刪減，并未獲得較為理想的結果，此外，將六元環(huán)調整為五元噻唑環(huán)，活性表現降低。在噠嗪環(huán)上進(jìn)行甲基取代優(yōu)化中，發(fā)現4位取代的活性要高于5位取代，但是活性還是低于無(wú)取代。
噠嗪核的優(yōu)化結果顯示，保留其起始結構是選擇，在對右側四甲基哌 啶的結構進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，降低哌 啶環(huán)的親脂性將會(huì )引起活性的下降，而將堿性的哌 啶環(huán)用醚環(huán)取代，如呋喃，發(fā)現活性完全喪失，不過(guò)這兩種修飾方式都能降低hERG結合活性，由上述結果可知右側四甲基哌 啶環(huán)的堿性和親脂性是化合物是提高SMN蛋白水平的重要因素，而連接哌 啶環(huán)和噠嗪核的linker，用醚鍵替代效果類(lèi)似。
左側的苯并噻吩環(huán)在優(yōu)化時(shí)，發(fā)現耐受性較好，能夠容忍多種芳環(huán)、芳雜環(huán)的取代，因此該位置不僅可以用于優(yōu)化化合物的活性，還可以調整化合物的理化性質(zhì)和ADME特征。初步優(yōu)化時(shí)，將苯并噻吩替換為噻吩，發(fā)現化合物活性喪失，而用苯并噻吩的電子等排體2-萘（6）取代時(shí)，活性保持，而1-萘基（5）則活性下降，主要是因為不能與噠嗪核保持一定的共平面性。當芳環(huán)鄰位有取代時(shí)，大部分化合物活性喪失，但是當芳環(huán)鄰位有羥基取代時(shí)，活性得到增強，但是也會(huì )造成較強的hERG抑制活性，將羥基用甲基封閉后，活性降低了近50倍！
分析上述結果，左側芳環(huán)與噠嗪核的共平面性是決定活性的關(guān)鍵因素！對化合物4和其甲氧基取代化合物4-OMe的單晶結構分析，發(fā)現前者萘環(huán)平面與噠嗪環(huán)平面的二面角遠小于后者，主要是因為羥基和噠嗪環(huán)中的氮原子形成氫鍵作用，而當羥基被替換為甲氧基后，氧的孤對電子與噠嗪環(huán)上的氮原子孤對電子的排斥作用，導致二面角增大，表現為活性降低或者喪失！
經(jīng)過(guò)初步的結構優(yōu)化后，將得到的幾個(gè)體外活性較好的化合物，如化合物2、3和4進(jìn)行體內實(shí)驗，以確認優(yōu)化成果，具體數據如表格所示。化合物2與1相比，只是將linker加了一個(gè)甲基，雖然對清除率影響不大，但是提高了化合物的血腦屏障透過(guò)率，主要是因為其減少氫鍵供體的數量，除此之外，化合物2的AUC以及生物利用度得到了明顯的提高，基于上述發(fā)現，保留linker的甲基化是合理的！對比上述三個(gè)化合物，選擇化合物3進(jìn)行進(jìn)一步的體內活性效果研究。
以SMN delta7的小鼠為模型，不同劑量下SMN蛋白的表達水平呈劑量依賴(lài)關(guān)系。采用三種不同劑量的化合物喂服模型小鼠，其存活時(shí)間明顯提高，但30 mg劑量下的總體表現低于10 mg劑量下的總體表現，表明化合物3存在一定的耐受性問(wèn)題，例如其較高的hERG結合活性。
將3中的氰基用不同芳雜環(huán)取代，發(fā)現其修飾的耐受性較好，用吡唑替換后（7），活性略有提高，但是顯著(zhù)降低了脫靶**，將linker用氧原子替代后，雖然活性未發(fā)生多大變化，但在SMN ELISA測試中，SMN蛋白表達水平略有提高，但是都未能改善hERG。
在前期對右側哌 啶環(huán)的優(yōu)化中，發(fā)現活性與其堿性和親脂性密切呈正相關(guān)，然而在生理pH條件下，與疏水中心鄰近的質(zhì)子化胺結構是造成hERG結合活性的重要因素，因此，降低親脂性以及pKa就成為了首選優(yōu)化策略！以化合物7為模板，對右側的哌 啶環(huán)進(jìn)行修飾，均未能得到較好的結果，在改善hERG的情況下，活性也會(huì )損失！對左側芳環(huán)引入一些極性基團，如將萘環(huán)替換為喹啉或異喹啉、吡唑連接位置調整、在吡唑上引入氨基、羥基等基團等，在活性保持的同時(shí)，也降低了hERG結合性，但由于部分化合物PSA的增大，導致透過(guò)性降低，如8和12，由于氨基的引入，10的生物利用度僅有4%。化合物9和12的PK數據較為平衡，但是在SMN ELISA測試中，SMN蛋白表達水平只提高了2.6倍，而SMN表達效果的為12，有3.1倍之多。
將化合物12的linker采用氧、亞甲基等替換，亞甲基（13）活性降低，但hERG結合性大有改善，氧取代和氮甲基取代，hERG性質(zhì)類(lèi)似，但氧取代的SMN蛋白表達水平（3.6倍），此外，氮甲基取代時(shí)（12）膜穿透性較差，因此優(yōu)選氧取代化合物進(jìn)入到臨床階段的，目前正在I/II期臨床研究，預計2020年完成！
總 結
mRNA前體的剪接是真核生物中基因表達的關(guān)鍵步驟。異常剪接會(huì )引起蛋白質(zhì)的結構和功能改變，是疾病發(fā)生的一個(gè)常見(jiàn)原因。據文獻報道，大約1/3的致病變異會(huì )引mRNA的異常剪接，基于Minigene技術(shù)的表型篩選方法，為攻克此類(lèi)疾病的治療提供了重要的方法，通過(guò)表型篩選得到理想的化合物后，再利用相關(guān)技術(shù)確認作用靶點(diǎn)，此類(lèi)策略是開(kāi)發(fā)First in class藥物非常有效的方法。在化合物的優(yōu)化過(guò)程中，優(yōu)化化合物構型、調整親脂性以及堿性，不僅會(huì )影響到化合物的ADME，而且是改善hERG性質(zhì)的重要方式。
點(diǎn)擊下圖，預登記觀(guān)展
合作咨詢(xún)
肖女士
021-33392297
Kelly.Xiao@imsinoexpo.com
2006-2025 上海博華國際展覽有限公司版權所有（保留一切權利）
滬ICP備05034851號-57
