8對手性片段大鬧蛋白組

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來源：美中藥源

2019-03-11

最近化學生物學大牛Cravatt發(fā)表了一篇用分子片段在細胞水平、蛋白組范圍為多個蛋白尋找小分子配體的工作。作者用8對互為對映體的小分子片段作為探針、設計了16個（8對對映體）所謂完全功能化片段（FFF）。

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最近化學生物學大牛Cravatt發(fā)表了一篇用分子片段在細胞水平、蛋白組范圍為多個蛋白尋找小分子配體的工作。作者用8對互為對映體的小分子片段作為探針、設計了16個（8對對映體）所謂完全功能化片段（FFF）。這些FFF由三部分組成，除了與蛋白結合的探針片段外、還有一個在紫外光照下可以與蛋白質反應的雙***和一個可以與疊氮在生物環(huán)境下高效反應的炔基。分子片段與蛋白結合后增加這些蛋白被雙***降解后形成卡賓捕捉的幾率，被捕捉蛋白再通過點擊反應被撈出，然后通過熒光或質譜鑒定是哪些蛋白沒能抵制住FFF的誘惑。

作者用這些FFF在PBMC和HEK293兩種細胞中釣魚，找到176個能與至少一個小分子片段結合的蛋白。這些找到新配體的蛋白有些有已知的小分子配體，作者證明這些已知配體（通常是活性腔配體）可以與這些片段競爭，說明這些片段并非與功能無關的結合腔結合。因為這些FFF與蛋白形成了共價結合物，所以分析FFF接在降解后蛋白的哪個多肽上也可以佐證結合腔。作者只用了8對對映體就為176個蛋白找到心儀配體，如果擴大FFF范圍有望為多數蛋白找到小分子配體、也可以根據成功率定義某個特定蛋白的成藥性。

藥源解析

這個工作涉及新藥發(fā)現早期階段的幾個重要方面、其FFF設計和用到的分析技術也很巧妙，值得解讀一下。靶點的成藥性是新藥發(fā)現立項的一個關鍵考慮，如果事先知道一個靶點成藥性很差廠家則可以放棄在篩選上的過度投入、避免浪費太多時間和資源。當然有些與疾病高度相關、但成藥性差的靶點如KRAS制藥業(yè)明知山有虎偏向虎山行是另一回事，成藥性這個信息還是十分關鍵的。這個工作如果擴展可能在蛋白組范圍為多數蛋白的成藥性分層。很多蛋白沒有已知小分子配體，為蛋白找到一個可以在細胞環(huán)境下結合的先導物是藥物優(yōu)化的第一步。在一定程度上這176個蛋白已經有了苗頭化合物。

這個工作的基本思路早就有了，但是細節(jié)上作者做了重要改進。分子片段因為比較小所以與任何蛋白結合都不會太強、選擇性也不會太好，作者定義的選擇性結合是兩個對映體捕捉的同一蛋白相差2.5倍以上。之所以比較對映體是因為卡賓化學反應活性極強、即使探針沒有與蛋白結合或者非特異結合也會通過隨機分子間碰撞捕捉住一些蛋白。而細胞內不同蛋白的表達量差很多，所以高表達蛋白按概率也會更多被捕捉。但因為蛋白結合腔通常是手性環(huán)境，所以對映體之間的差別可以作為排除非特異結合的一個指標（如果兩個對映體捕捉同量蛋白說明特異性結合沒有起到關鍵作用）。所以通過這個程序捕捉的蛋白并不一定是結合力最強的蛋白、也不一定是被捕捉量的蛋白，因為如果結合腔不能區(qū)分探針手性無論結合力多強都會被當作噪音（對映體之間無差別）被去掉。這是這個工作設計上的一個重要改進。

通常一個靶點要找到有用的小分子配體都得篩選上百萬的化合物庫，他們怎么只用16個片段就篩選了整個蛋白組、并為176個蛋白找到了配體了呢？當然原因是探針濃度的慷慨和結合強度的容忍。探針濃度在20-200 uM之間，而因為篩選的陽性標準是化學反應速率較小的差別（2.5倍）、所以對結合強度要求可能非常低。另外捕捉蛋白量的不同也可能是對映體結合力相同但卡賓與蛋白C-H的插入反應速率有差別，但作者認為這也是個有用信息。即使如此作者只用8對對映體就捕捉了176個蛋白還是很高效，尤其考慮到80%的蛋白只與一個探針結合，說明結合有一定選擇性。這些探針都是結構比較相似的氨基取代芳香化合物，是GPCR受體的所謂優(yōu)勢骨架，但這176個蛋白中GPCR并不多。很多與這些化合物結合的蛋白是酶，但也有一些比較難成藥的蛋白如轉錄因子。

除了設計這個工作中用的一些技術也很巧妙。多數能令蛋白C-H鍵參與的化學反應都需要酸堿催化、或高溫、或需要有機溶劑，在pH7室溫水溶液中能與天然蛋白加成的反應半只手就能數過來。打撈被捕捉蛋白的點擊反應知道的人很多，但不一定有很多人理解Sharpless從茫茫人海中找到這個不起眼的古老化學反應需要的功力。從看著就像千里馬的馬中找到千里馬容易，但從長相普通的馬中找到千里馬要看手藝。因為捕捉蛋白富集比例只有幾倍，所以準確分析很重要。他們把細胞分成兩份、分別用兩個對映體處理，但其中一份用同位素標記的氨基酸培養(yǎng)。分析時把兩份細胞混合起來做高通量質譜、這樣就知道哪個蛋白來自哪份細胞。同樣也可以用同位素標記的甲醛衍生化捕捉蛋白，而另一個更高通量的分析方法準確性也足夠可靠。

制藥工業(yè)中這個體系更經常用于候選藥物在細胞內與靶點的結合確證。在純化蛋白有活性的化合物需要有在細胞環(huán)境下與靶點蛋白相互作用的證據，否則會成為一個開發(fā)風險。這個數據雖然不一定必須要有，很多上市藥物當年沒有這個數據。但靶點關聯(lián)類似探險的地圖，雖然沒有地圖你也可能找到寶藏并安全返回、但犧牲在路上的風險大增。

找到一個能與蛋白結合的探針只是萬里長征第一步。這樣小的配體要優(yōu)化成可以作為藥物使用的分子需要很長時間，通常需要有蛋白晶體結構的指導、否則難度太大。足夠活性的化合物找到后可能在動物模型中無法重復基因學研究結果、或者**太大。即使一切順利進入臨床也只有5-10%的可能上市、有1-2%的可能成為公司可以依賴的大產品。這個工作雖然非常出色，但只相當于登山從大本營出發(fā)、與登頂還相隔無數磨難。藥物發(fā)現就是這么難。

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