新聞事件
最近化學(xué)生物學(xué)大牛Cravatt發(fā)表了一篇用分子片段在細胞水平、蛋白組范圍為多個(gè)蛋白尋找小分子配體的工作。作者用8對互為對映體的小分子片段作為探針、設計了16個(gè)（8對對映體）所謂完全功能化片段（FFF）。這些FFF由三部分組成，除了與蛋白結合的探針片段外、還有一個(gè)在紫外光照下可以與蛋白質(zhì)反應的雙***和一個(gè)可以與疊氮在生物環(huán)境下高效反應的炔基。分子片段與蛋白結合后增加這些蛋白被雙***降解后形成卡賓捕捉的幾率，被捕捉蛋白再通過(guò)點(diǎn)擊反應被撈出，然后通過(guò)熒光或質(zhì)譜鑒定是哪些蛋白沒(méi)能抵制住FFF的誘惑。
作者用這些FFF在PBMC和HEK293兩種細胞中釣魚(yú)，找到176個(gè)能與至少一個(gè)小分子片段結合的蛋白。這些找到新配體的蛋白有些有已知的小分子配體，作者證明這些已知配體（通常是活性腔配體）可以與這些片段競爭，說(shuō)明這些片段并非與功能無(wú)關(guān)的結合腔結合。因為這些FFF與蛋白形成了共價(jià)結合物，所以分析FFF接在降解后蛋白的哪個(gè)多肽上也可以佐證結合腔。作者只用了8對對映體就為176個(gè)蛋白找到心儀配體，如果擴大FFF范圍有望為多數蛋白找到小分子配體、也可以根據成功率定義某個(gè)特定蛋白的成藥性。
藥源解析
這個(gè)工作涉及新藥發(fā)現早期階段的幾個(gè)重要方面、其FFF設計和用到的分析技術(shù)也很巧妙，值得解讀一下。靶點(diǎn)的成藥性是新藥發(fā)現立項的一個(gè)關(guān)鍵考慮，如果事先知道一個(gè)靶點(diǎn)成藥性很差廠(chǎng)家則可以放棄在篩選上的過(guò)度投入、避免浪費太多時(shí)間和資源。當然有些與疾病高度相關(guān)、但成藥性差的靶點(diǎn)如KRAS制藥業(yè)明知山有虎偏向虎山行是另一回事，成藥性這個(gè)信息還是十分關(guān)鍵的。這個(gè)工作如果擴展可能在蛋白組范圍為多數蛋白的成藥性分層。很多蛋白沒(méi)有已知小分子配體，為蛋白找到一個(gè)可以在細胞環(huán)境下結合的先導物是藥物優(yōu)化的第一步。在一定程度上這176個(gè)蛋白已經(jīng)有了苗頭化合物。
這個(gè)工作的基本思路早就有了，但是細節上作者做了重要改進(jìn)。分子片段因為比較小所以與任何蛋白結合都不會(huì )太強、選擇性也不會(huì )太好，作者定義的選擇性結合是兩個(gè)對映體捕捉的同一蛋白相差2.5倍以上。之所以比較對映體是因為卡賓化學(xué)反應活性極強、即使探針沒(méi)有與蛋白結合或者非特異結合也會(huì )通過(guò)隨機分子間碰撞捕捉住一些蛋白。而細胞內不同蛋白的表達量差很多，所以高表達蛋白按概率也會(huì )更多被捕捉。但因為蛋白結合腔通常是手性環(huán)境，所以對映體之間的差別可以作為排除非特異結合的一個(gè)指標（如果兩個(gè)對映體捕捉同量蛋白說(shuō)明特異性結合沒(méi)有起到關(guān)鍵作用）。所以通過(guò)這個(gè)程序捕捉的蛋白并不一定是結合力最強的蛋白、也不一定是被捕捉量的蛋白，因為如果結合腔不能區分探針手性無(wú)論結合力多強都會(huì )被當作噪音（對映體之間無(wú)差別）被去掉。這是這個(gè)工作設計上的一個(gè)重要改進(jìn)。
通常一個(gè)靶點(diǎn)要找到有用的小分子配體都得篩選上百萬(wàn)的化合物庫，他們怎么只用16個(gè)片段就篩選了整個(gè)蛋白組、并為176個(gè)蛋白找到了配體了呢？當然原因是探針濃度的慷慨和結合強度的容忍。探針濃度在20-200 uM之間，而因為篩選的陽(yáng)性標準是化學(xué)反應速率較小的差別（2.5倍）、所以對結合強度要求可能非常低。另外捕捉蛋白量的不同也可能是對映體結合力相同但卡賓與蛋白C-H的插入反應速率有差別，但作者認為這也是個(gè)有用信息。即使如此作者只用8對對映體就捕捉了176個(gè)蛋白還是很高效，尤其考慮到80%的蛋白只與一個(gè)探針結合，說(shuō)明結合有一定選擇性。這些探針都是結構比較相似的氨基取代芳香化合物，是GPCR受體的所謂優(yōu)勢骨架，但這176個(gè)蛋白中GPCR并不多。很多與這些化合物結合的蛋白是酶，但也有一些比較難成藥的蛋白如轉錄因子。
除了設計這個(gè)工作中用的一些技術(shù)也很巧妙。多數能令蛋白C-H鍵參與的化學(xué)反應都需要酸堿催化、或高溫、或需要有機溶劑，在pH7室溫水溶液中能與天然蛋白加成的反應半只手就能數過(guò)來(lái)。打撈被捕捉蛋白的點(diǎn)擊反應知道的人很多，但不一定有很多人理解Sharpless從茫茫人海中找到這個(gè)不起眼的古老化學(xué)反應需要的功力。從看著(zhù)就像千里馬的馬中找到千里馬容易，但從長(cháng)相普通的馬中找到千里馬要看手藝。因為捕捉蛋白富集比例只有幾倍，所以準確分析很重要。他們把細胞分成兩份、分別用兩個(gè)對映體處理，但其中一份用同位素標記的氨基酸培養。分析時(shí)把兩份細胞混合起來(lái)做高通量質(zhì)譜、這樣就知道哪個(gè)蛋白來(lái)自哪份細胞。同樣也可以用同位素標記的甲醛衍生化捕捉蛋白，而另一個(gè)更高通量的分析方法準確性也足夠可靠。
制藥工業(yè)中這個(gè)體系更經(jīng)常用于候選藥物在細胞內與靶點(diǎn)的結合確證。在純化蛋白有活性的化合物需要有在細胞環(huán)境下與靶點(diǎn)蛋白相互作用的證據，否則會(huì )成為一個(gè)開(kāi)發(fā)風(fēng)險。這個(gè)數據雖然不一定必須要有，很多上市藥物當年沒(méi)有這個(gè)數據。但靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)類(lèi)似探險的地圖，雖然沒(méi)有地圖你也可能找到寶藏并安全返回、但犧牲在路上的風(fēng)險大增。
找到一個(gè)能與蛋白結合的探針只是萬(wàn)里長(cháng)征第一步。這樣小的配體要優(yōu)化成可以作為藥物使用的分子需要很長(cháng)時(shí)間，通常需要有蛋白晶體結構的指導、否則難度太大。足夠活性的化合物找到后可能在動(dòng)物模型中無(wú)法重復基因學(xué)研究結果、或者**太大。即使一切順利進(jìn)入臨床也只有5-10%的可能上市、有1-2%的可能成為公司可以依賴(lài)的大產(chǎn)品。這個(gè)工作雖然非常出色，但只相當于登山從大本營(yíng)出發(fā)、與登頂還相隔無(wú)數磨難。藥物發(fā)現就是這么難。
點(diǎn)擊下圖，預登記觀(guān)展
合作咨詢(xún)
肖女士
021-33392297
Kelly.Xiao@imsinoexpo.com
2006-2025 上海博華國際展覽有限公司版權所有（保留一切權利）
滬ICP備05034851號-57
