帶磁性的核在外加磁場(chǎng)中會(huì )產(chǎn)生能級裂分，吸收對應波長(cháng)的電磁波就會(huì )發(fā)生能級的躍遷，停止電磁波照射后通過(guò)自旋晶格弛豫回到平衡態(tài)，產(chǎn)生核磁共振效應。經(jīng)過(guò)核磁共振科學(xué)家多年不懈的努力后，二維核磁技術(shù)終于在20世紀70年代開(kāi)始走向成熟，走向應用，典型的有同核COSY、DQF-COSY、TOESY、NOESY、ROESY技術(shù)，異核HMQC、HMSC、HSQC技術(shù)，另外還有研究核與核之間相互作用的NOE技術(shù)。新藥發(fā)現的一個(gè)主要途徑是化合物文庫和天然化合物的的篩選以及為了活性性質(zhì)優(yōu)化的大量結構類(lèi)似化合物的合成。這些過(guò)程耗費大量人力物力，而且風(fēng)險還很高，而這些技術(shù)為研究蛋白質(zhì)的結構和小分子與蛋白質(zhì)之間的相互作用帶來(lái)了極大的便利。從20世紀末核磁共振技術(shù)首次成功運用于先導化合物的發(fā)現過(guò)程開(kāi)始，一場(chǎng)新的藥物發(fā)現技術(shù)革命悄然誕生。以下我們主要介紹核磁共振技術(shù)在先導化合物篩選過(guò)程中的開(kāi)創(chuàng )性應用實(shí)例。
01、FK506結合蛋白抑制劑先導化合物的發(fā)現
FK506結合蛋白和FK506結合，抑制鈣調磷酸酶和阻止T細胞活化，為了尋找FK506和結合蛋白結合的抑制劑，Fesik等人避開(kāi)了傳統的篩選路徑，開(kāi)發(fā)了一套嶄新的藥物先導化合物篩選發(fā)現途徑。
A是靶標蛋白的三維結構，通過(guò)第一輪小分子化合物配體篩選得到B，小分子與蛋白的結合作用可以通過(guò)N同位素標記的HSQC技術(shù)觀(guān)察酰胺質(zhì)子和氮原子的化學(xué)位移來(lái)識別，由于蛋白是N同位素標記，而化合物沒(méi)有進(jìn)行N同位素標記所以小分子底物不會(huì )干擾蛋白化學(xué)位移信號，從而提高了信噪比。第一個(gè)配體得到后經(jīng)過(guò)一系列的藥物化學(xué)修飾得到優(yōu)化后的C，下面的目標則是尋找結合蛋白相鄰位點(diǎn)的配體，確定的依據仍是核磁譜圖中化學(xué)位移變化的相關(guān)情況，第二個(gè)配體粗選后繼續經(jīng)過(guò)藥物化學(xué)的修飾得到活性的小分子化合物如上圖E。在兩個(gè)先導配體被選定后，通過(guò)核磁共振或者X-射線(xiàn)衍射技術(shù)得到三元復合物在空間的相對位置和小分子配體的空間取向，通過(guò)設計合適的連接子將兩個(gè)配體片段連接起來(lái)得到最后的先導化合物如圖上圖F。
在FK506結合蛋白的抑制劑篩選過(guò)程中，第一輪篩選發(fā)現化合物文庫發(fā)現如下圖化合物1具有的活性，化合物1不經(jīng)過(guò)進(jìn)一輪的優(yōu)化作為第一個(gè)配體，可以通過(guò)酰胺化學(xué)位移的變化斷定化合物1的結合位置和FK506哌 啶酸部分的結合位置一致。在化合物1飽和的條件下，繼續尋找與相鄰結合位點(diǎn)結合的小分子配體，通過(guò)對化合物庫的篩選初步得到化合物2具有一定的活性，通過(guò)對在化合物1飽和的情況下化合物2加入后化學(xué)位移的變化，可以斷定化合物2和化合物1的結合位點(diǎn)相近。
化合物2經(jīng)過(guò)經(jīng)過(guò)進(jìn)一輪的構效關(guān)系研究得到最終高活性的化合物3。
通過(guò)基于同位素濾波核磁共振試驗建立三元復合物的空間模型，化合物1的甲酯結構和化合物3的苯環(huán)上的羥基結構在空間位置上比較接近，設計連接子跨過(guò)空間連接兩個(gè)小分子配體，要保證設計的連接子不影響小分子配體在空間的位置和結構取向，設計如下圖的分子結構。
最終結果顯示化合物10具有的活性，化合物14的分子式如下圖，它采用了另一種連接方式，活性也達到了49nM。
為了觀(guān)察兩個(gè)小分子配體在連接之前和連接之后與結合蛋白的結合作用部位的變化，分別進(jìn)行NOE研究，結果發(fā)現化合物1和化合物14的哌 啶酸部分和三甲氧基苯基部分結合部位一樣，與蛋白形成疏水相互作用，另外化合物3與化合物14的結合位置相似，化合物3的苯甲酰環(huán)與蛋白中Gln53，IIe56，Arg57的相互作用在化合物14與蛋白的相互作用中沒(méi)看到，這又說(shuō)明了盡管二者作用位點(diǎn)相似，但連接子的引入確實(shí)影響了化學(xué)位移的變化。
從以上的實(shí)驗可以看出化合物1的Kd=2uM，化合物3的Kd=0.1mM，當利用連接子巧妙地連接兩個(gè)小分子配體后，得到的化合物活性都在nM級別。兩個(gè)配體可通過(guò)不同的連結子(linker)連接起來(lái)，這種連接可以從焓變和熵變對結合能的貢獻上得到理論支持[3]，這使得先導化合物發(fā)現效率實(shí)現了一個(gè)質(zhì)的飛越。
02、質(zhì)溶解素（MMP-3）非肽類(lèi)抑制劑先導化合物的發(fā)現
基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是鋅依賴(lài)的家族內切蛋白酶，包括膠原酶，明膠酶和基質(zhì)溶解素。該酶家族參與基質(zhì)降解和組織重塑，并且當過(guò)表達或失調時(shí)與關(guān)節炎和腫瘤轉移等病癥相關(guān)。盡管已經(jīng)發(fā)現了基于底物特異性設計的有效的基于肽的抑制劑，但是許多這些化合物表現出差的生物利用度。已發(fā)現幾種非肽天然產(chǎn)物可抑制這類(lèi)酶，如聚天冬氨酸和四環(huán)素衍生物。然而，這些化合物僅表現出中等的抑制活性。利用核磁共振技術(shù)S. W. Fesik等人成功的找到了對基質(zhì)溶解素活性很高的先導化合物。
由于許多已知的MMP抑制劑含有異羥肟酸部分，用HSQC譜方法從化合物庫中篩選到乙酰羥胺(CH3CONHOH)對基質(zhì)溶酶的親和力很弱，Kd=17mM，由于它的分子較小以及在緩沖液中的溶解度較大(大于500mM)，未作任何優(yōu)化選作第一配體。
在飽和量的乙酰羥胺存在下，用HSQC譜方法發(fā)現聯(lián)苯及其類(lèi)似物可以結合基質(zhì)溶酶Kd在mM范圍，經(jīng)過(guò)近40余個(gè)聯(lián)苯化合物的結構-活性研究比較(如下圖)，發(fā)現3'-氰甲基-4-羥基聯(lián)苯(26)與基質(zhì)溶酶的親合力Kd達0.02mM。
通過(guò)對乙酰羥胺，3'-氰甲基-4-羥基聯(lián)苯類(lèi)似物以及基質(zhì)溶酶的三元配合物的NMR研究，設計合成了11個(gè)化合物(45～55)，生物活性實(shí)驗證明，與原有單體化合物相比，所有化合物的活性均有增強。對基質(zhì)溶酶抑制活性的化合物50和53其IC50分別為25和15nM，活性增強近千倍。
03、“SAR by NMR”和組合化學(xué)的對比
“SAR by NMR”方法在概念上類(lèi)似于組合化學(xué)，然而這兩種方法有本質(zhì)的區別，在組合化學(xué)中發(fā)現配體需要制備測試大量的化合物，不幸的是，合成方案的選擇和生物測定往往既困難又費時(shí)，進(jìn)而相對統一的條件需要限制了有用的分子構建模塊及化合物的多樣性。在“SAR by NMR”方法中，配體已預選進(jìn)行了優(yōu)化，所以只需合成少數幾個(gè)化合物即可。另一方面“SAR by NMR”方法不同于組合化學(xué)，篩選小分子化合物的范圍僅僅受到水溶解度達mM濃度的限制，結果可以收集到多種多樣的化合物樣品[5]。
總結
我們介紹了核磁共振技術(shù)在新藥研發(fā)先導化合物發(fā)現中的運用，需要注意的是以上這種核磁共振技術(shù)需要大量15N同位素標記的結合蛋白，另外結合蛋白的分子量大都在40KD以下等一系列技術(shù)限制，不過(guò)可喜的是目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了兩種不需要15N標記蛋白的新方法-一維馳豫編輯和擴散編輯NMR方法[6]，彌補了這種方法的不足。
SPA(閃爍分析法)存在著(zhù)**污染的環(huán)保問(wèn)題，熒光分析法存在著(zhù)底物濃度效應，熒光猝滅效應，化合物自身熒光干擾等問(wèn)題，高通量篩選過(guò)程中會(huì )出現假陽(yáng)性、假陰性，自動(dòng)化程度高可是先導化合物發(fā)現效率低，而計算機輔助藥物設計則存在著(zhù)力場(chǎng)選擇簡(jiǎn)單，計算過(guò)程繁瑣，與現實(shí)情況符合性存疑等問(wèn)題。新藥研發(fā)的技術(shù)變革從未止步，相信隨著(zhù)核磁共振技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，必將繼續提高先導化合物的發(fā)現效率，使得整個(gè)新藥研發(fā)周期縮短。
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