張鋒團隊帶來(lái)第三款CRISPR基因組編輯系統顯著(zhù)減少脫靶效應

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來(lái)源：學(xué)術(shù)經(jīng)緯

2019-01-23

今日，CRISPR-Cas基因編輯系統的先驅之一張鋒教授在《自然》子刊《Nature Communications》發(fā)布一項重要進(jìn)展，報告了第三個(gè)可以編輯人類(lèi)細胞基因組的CRISPR-Cas系統：CRISPR-Cas12b。

多功能基因組編輯系統CRISPR-Cas的問(wèn)世，掀起了一場(chǎng)生物技術(shù)革命。在科學(xué)研究和醫療研發(fā)方面，這套基因編輯工具得到廣泛應用，以此為基礎的基因編輯療法也展開(kāi)臨床試驗，在治療人類(lèi)遺傳病方面初現潛力。

這一系統中的“元老”成員就是我們已經(jīng)熟悉的Cas9。不過(guò)Cas9也并非沒(méi)有限制，比如切割非靶點(diǎn)序列的脫靶效應就是一個(gè)問(wèn)題。鑒于CRSPR-Cas系統在微生物中廣泛存在，科學(xué)家們將Cas蛋白的類(lèi)型范圍不斷擴大，尋找新秀，例如Cas12a。

在與Cas9、Cas12a同屬2類(lèi)CRISPR系統的Cas蛋白中，還有一個(gè)富有潛力的成員，就是Cas12b（過(guò)去被稱(chēng)為C2c1）。Cas12b蛋白比Cas9和Cas12a更小，因此更容易通過(guò)病毒載體實(shí)現細胞間遞送。

雖然有這樣的優(yōu)勢，Cas12b的開(kāi)發(fā)卻遇到了一個(gè)阻礙。性能的Cas12b來(lái)自一種嗜酸耐熱菌（Alicyclobacillus acidoterrestris），但它作為DNA裂解酶的活性需要高達48℃。也就是說(shuō)，如果放進(jìn)哺乳動(dòng)物細胞內，達不到這種Cas12b的溫度要求，酶活性就不能發(fā)揮。怎么“解鎖”這種Cas蛋白呢？

為了適用于人類(lèi)基因組編輯，張鋒教授和同事們首先在Cas12b蛋白家族中尋找喜歡常溫的成員。最終，根據同源序列比對，他們從一種叫作外村尚芽孢桿菌（Bacillus hisashii）的細菌中鑒定出了在人體體溫（37℃時(shí)）能保持核酸酶活性的BhCas12b。并且，研究人員還通過(guò)調整指導RNA（sgRNA）的結構，讓Cas12b的效率得到大幅提升。

可是，新的問(wèn)題來(lái)了。體外切割實(shí)驗發(fā)現，原始結構的Cas12b在DNA雙鏈斷裂時(shí)會(huì )切割非靶標單鏈，并且溫度越低，這種錯誤發(fā)生得越多。為了解決這個(gè)問(wèn)題，研究者對Cas12b進(jìn)行了工程改造。根據蛋白質(zhì)晶體結構的線(xiàn)索，研究人員通過(guò)4個(gè)點(diǎn)突變，得到了重新設計的新Cas12b，讓酶的活性位點(diǎn)更容易和DNA靶序列接近。

經(jīng)過(guò)重新設計的Cas12b，基因組編輯的潛能如何呢？在細胞培養實(shí)驗中，研究人員針對多個(gè)基因的多個(gè)靶序列考察了Cas12b的編輯效率。對隨機引入插入缺失的分析結果顯示，新的Cas12b的編輯效率與Cas9和Cas12a相當、甚至更高，足以在人體細胞中作為可編程的基因組編輯工具。

除了有效性，特異性對于一款強大的基因組編輯工具來(lái)說(shuō)也非常重要。這一點(diǎn)，研究團隊也在人類(lèi)細胞中利用GUIDE-seq技術(shù)對全基因組范圍內的脫靶效應進(jìn)行了檢測。結果表明，相比常用的Cas9，Cas12b導致的錯誤插入缺失都要少得多，脫靶性顯著(zhù)降低。

研究團隊相信，在繼Cas9和Cas12a之后，改造的Cas12b將以其分子量小和靶向特異性高的兩大特點(diǎn)，成為又一款在體編輯人類(lèi)基因組的有力工具。并且，這一顯著(zhù)提升Cas12b效率的改造工程也為解鎖更多CRISPR工具提供了富有啟發(fā)的指導。

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