磷酸酶（phosphatases）的作用是將多種蛋白質(zhì)上的磷酸基團去掉。很久以來(lái)，它們已經(jīng)被證明與肥胖癥、糖尿病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病等疾病有關(guān)。雖然和它們相對應的蛋白激酶已經(jīng)是十多個(gè)FDA批準藥物的靶點(diǎn)，但是安全有效的磷酸酶抑制劑仍然難以尋覓。

       這種狀況正在改變。目前至少有6個(gè)磷酸酶抑制劑在臨床試驗中接受檢驗。近日《Nature Reviews Drug Discovery》上刊登的一篇文章描述了這一領(lǐng)域的突破性進(jìn)展。雖然大多數小分子藥與它們靶點(diǎn)的活性位點(diǎn)相結合，這些磷酸酶抑制劑的作用方式卻是與活性位點(diǎn)之外的別構（allosteric）位點(diǎn)相結合。別構抑制可能是打破磷酸酶“不可成藥”性的成功策略。今天藥明康德微信團隊將跟讀者分享這篇文章的精彩內容。

       磷酸酶“不可成藥”性的由來(lái)

       蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）的經(jīng)典范例是PTP1B。這一蛋白讓PTP家族擔上了“不可成藥”的名聲。在上世紀80年代，美國冷泉港實(shí)驗室的Nick Tonks博士發(fā)現了PTP1B，隨后的研究表明它能夠調控胰島素敏感性。對于Tonks博士來(lái)說(shuō)，能夠阻斷PTP1B從酪氨酸上去除磷酸基團活性的抑制劑有著(zhù)非常明顯的抗糖尿病潛力。

       然而要達到這一目標，研究人員需要先證明這個(gè)蛋白家族的功能不只是常規性地清理蛋白激酶留下的磷酸基團。很多研究人員擔心抑制磷酸酶會(huì )對多種不同信號通路產(chǎn)生影響，導致嚴重副作用。但是到上世紀90年代末，PTP1B缺失的動(dòng)物模型表明，抑制磷酸酶可以產(chǎn)生“高度特異性表型”。兩款獨立生成的PTP1B缺失小鼠模型表明，PTP1B失活可以提高胰島素敏感度，而且讓動(dòng)物對飲食導致的肥胖產(chǎn)生抗性。

       這時(shí)候醫藥公司已經(jīng)爭先恐后地開(kāi)始以PTP1B作為靶點(diǎn)進(jìn)行藥物研發(fā)。然而藥物研發(fā)過(guò)程困難重重，磷酸化的酪氨酸是一個(gè)極性底物，這意味著(zhù)能夠與PTP1B活性口袋相結合的配體也大多是極性分子。這導致篩選出來(lái)的化合物通常不適合口服，生物利用度低，而且不容易穿過(guò)細胞膜。

       只有少數幾個(gè)公司能夠堅持將研發(fā)過(guò)程推動(dòng)到臨床后期，惠氏（Wyeth）公司將它的候選藥物推進(jìn)到2期臨床，但是由于療效不足和副作用的原因在2002年停止開(kāi)發(fā)。重復的失敗讓研發(fā)人員對這一蛋白家族的興趣不斷減弱。“人們對活性口袋的研究已經(jīng)很徹底了，” HotSpot Therapeutics公司聯(lián)合創(chuàng )始人兼首席科學(xué)官Geraldine Harriman博士說(shuō)：“我不認為以這類(lèi)蛋白的活性口袋為靶點(diǎn)有任何光明的前景。”

       在這些研究中的一個(gè)特例是Aerpio Pharmaceuticals公司的AKB-9778。它與VE-PTP的催化位點(diǎn)相結合。通過(guò)直接皮下注射藥物來(lái)治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變，它避開(kāi)了口服遞送藥物面對的挑戰。

       別構抑制策略帶來(lái)新的希望

       當以PTP活性位點(diǎn)為靶點(diǎn)的研究不斷碰壁時(shí)，使用別構抑制策略抑制SHP2磷酸酶的進(jìn)展讓人們重新燃起了對PTP家族的希望。

       SHP2是一個(gè)久經(jīng)驗證的PTP癌基因，它正在成為一個(gè)令人關(guān)注的癌癥靶點(diǎn)。一部分原因是SHP2是多條激活RAS的信號通路匯聚的節點(diǎn)， 而RAS的激活對癌細胞的生長(cháng)和存活都非常重要。“幾乎所有受體酪氨酸激酶（RTK）以激活SHP2為主要途徑，甚至是唯一途徑來(lái)激活RAS，”Revolution Medicines公司的首席執行官Mark Goldsmith先生說(shuō)：“因此SHP2抑制劑可能在這個(gè)關(guān)鍵節點(diǎn)上將那些不同的RTK基因突變一網(wǎng)打盡，用一個(gè)分子抑制所有活性。”

       由于蛋白激酶與SHP2信號通路的重疊，SHP2抑制劑可以與激酶抑制劑聯(lián)用對相互連接的信號通路進(jìn)行雙重抑制。這種組合療法可能比單一療法更為有效，而且讓腫瘤不易產(chǎn)生藥物抗性。最近在《Nature Medicine》上發(fā)表的一項研究中，研究人員表明對ALK抑制劑產(chǎn)生抗性患者的細胞，在接受ALK和SHP2抑制劑聯(lián)用治療后，對ALK抑制劑重新敏感。“我認為這可以適用于多種蛋白激酶。”Goldsmith先生說(shuō)。

       而且，SHP2與免疫檢查點(diǎn)蛋白PD1相互作用，可以調節T細胞的活性。雖然這一功能的重要性還仍未確認，但是最近的一篇《Cell》科學(xué)論文顯示SHP2抑制劑可能有提高T細胞免疫療法的潛力。

       諾華（Novartis）公司是第一個(gè)成功靶向SHP2的公司，該公司在2016年《自然》雜志上發(fā)表的研究表明，小分子抑制劑SHP099能夠將致癌的磷酸酶固定在失活的構象上。由于靶向催化中心的磷酸酶抑制劑存在的極性和生物利用度方面的問(wèn)題已經(jīng)為人所知，諾華公司的研發(fā)項目一開(kāi)始就以別構抑制為目標。

       他們設計了一種篩選測試，旨在發(fā)現能夠與全長(cháng)SHP2結合的小分子。用第二種篩選找出能夠與這一磷酸酶的活性位點(diǎn)相結合的小分子。然后將與活性位點(diǎn)結合的小分子從第一種篩選的結果中刨去。這樣研究人員可以從剩下的小分子中發(fā)掘別構調節因子。諾華開(kāi)發(fā)的TNO155在2017年已經(jīng)進(jìn)入治療實(shí)體瘤的1期臨床試驗。

       “我認為使用排除法的藥物開(kāi)發(fā)手段來(lái)靶向其它蛋白是一種可行的策略，”諾華公司的資深科學(xué)家Matt LaMarche博士說(shuō)：“如果你能夠設計出一種檢測，將你不想要的分子過(guò)濾掉，你就可以簡(jiǎn)化篩選模式。”

       諾華的研究團隊已經(jīng)又設計出一種檢測，可以刨除與SHP009結合位點(diǎn)結合的小分子，這讓他們發(fā)現了另一個(gè)別構化合物，它可以與SHP2的另一個(gè)別構位點(diǎn)相結合。

       這些研究項目讓LaMarche博士對發(fā)現磷酸酶抑制劑的可能性產(chǎn)生了新的領(lǐng)悟。“如果是探索別構機制的話(huà)，我會(huì )愿意開(kāi)發(fā)磷酸酶的靶向抑制劑。在開(kāi)發(fā)別構磷酸酶抑制劑的項目中，你在重新書(shū)寫(xiě)藥物發(fā)現的準則，這是非常令人興奮的事。”

       別構抑制劑的利與弊

       然而別構抑制劑的藥物發(fā)現策略也有自己的缺陷，其中包括時(shí)間和資本上的投入更高。部分原因是使用全長(cháng)蛋白進(jìn)行篩選比使用催化亞基更具有挑戰性，全長(cháng)蛋白更容易從溶液中沉淀出來(lái)，聚集，或者出現物理化學(xué)方面的異常行為。而且即便發(fā)現了好的別構先導化合物，弄清它與靶點(diǎn)蛋白的結合位點(diǎn)也并不容易，這讓詳細闡明化合物的作用機制和理解結構與活性之間的關(guān)系變得很具挑戰性。已有的小分子篩選庫可能更富含與活性位點(diǎn)結合的化合物，因而可能不利于篩選別構抑制劑。

       然而，在適合的情況下，例如發(fā)現用其它方法無(wú)法成藥的靶點(diǎn)的抑制劑，這些投入是值得的。而且，別構抑制劑除了擴展靶點(diǎn)空間以外，還能帶來(lái)其它益處。例如，所有PTP的活性位點(diǎn)都需要與磷酸化的酪氨酸結合，不同PTP之間的活性口袋非常類(lèi)似。這意味著(zhù)很難發(fā)現特異性抑制一個(gè)PTP而不對其它PTP產(chǎn)生影響的小分子。而不同磷酸酶的別構位點(diǎn)不見(jiàn)得是保守的，因此藥物研發(fā)人員可以將別構抑制劑的特異性提高一個(gè)層次。Tonks博士希望別構藥物發(fā)現的策略可以最終帶來(lái)PTP1B抑制劑。在2014年，他發(fā)現一個(gè)稱(chēng)為trodusquemine的PTP1B抑制劑可能在HER2陽(yáng)性乳腺癌中具備療效。

       DepYmed公司獲得了開(kāi)發(fā)這一藥物治療癌癥的研發(fā)權。雖然該公司在2017年停止了開(kāi)發(fā)這一藥物的1期臨床試驗，但是它正在開(kāi)發(fā)新一代別構分子DPM-1001在多種適應癥上的應用。

       “讓我非常興奮的是我們可以擴展PTP1B抑制劑的應用領(lǐng)域，它不但可以用于治療癌癥、糖尿病和肥胖癥，還可以治療神經(jīng)系統的疾病。“Tonks博士說(shuō)。在2015年，他的研究表明PTP1B可能成為治療Rett綜合征的靶點(diǎn)，這是一種神經(jīng)發(fā)育疾病。

       ▲磷酸酶抑制劑研發(fā)管線(xiàn)部分項目（圖片來(lái)源：參考資料[1]）

       充滿(mǎn)潛力的磷酸酶抑制劑領(lǐng)域

       磷酸酶抑制劑領(lǐng)域仍然充滿(mǎn)了機會(huì )。基因泰克公司的研究人員去年對磷酸酶進(jìn)行了基因組和進(jìn)化分析，他們發(fā)現了189個(gè)已知或可能編碼人類(lèi)磷酸酶的基因。其中40（21%）個(gè)在癌癥、神經(jīng)退行性疾病、耳聾和糖尿病等疾病中有和疾病相關(guān)的變異。

       工業(yè)界對PTP在疾病中的功能非常重視，而別構抑制劑不僅可以打破PTP的不可成藥性，還可能拓展絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶（PPP）抑制劑的開(kāi)發(fā)。

       PPP抑制劑的研發(fā)需要面對和PTP不同的挑戰。PPP蛋白是由多個(gè)亞基構成的全酶，它的催化亞基通過(guò)與調控亞基相結合來(lái)賦予全酶的底物特異性。因此上百個(gè)不同PPP全酶的催化亞基都是保守的。這導致PPP抑制劑的風(fēng)險是可能全面阻斷所有的去磷酸化。在上世紀90年代開(kāi)發(fā)的PP1PPP催化抑制劑“殺死細胞的速度比任何我曾經(jīng)放到培養皿里的有毒物質(zhì)都快。”分子生物學(xué)家Anne Bertolotti博士說(shuō)。

       然而B(niǎo)ertolotti博士發(fā)現了篩選具有選擇性的PPP抑制劑的方法。通過(guò)篩選防止蛋白受錯誤折疊影響的分子，她幸運地發(fā)現一個(gè)具有選擇性的PPP抑制劑，這項工作在2011年發(fā)表在《科學(xué)》期刊上。隨后的研究帶來(lái)了這一化合物的改良衍生物——Sephin1。它在臨床前研究中表現出治療腓骨肌萎縮癥（Charcot–Marie–Tooth）和肌萎縮側索硬化癥（ALS）的潛力。InFlectis BioSciences公司將這款PPP1R15A抑制劑推進(jìn)到1期臨床試驗，現在它的名字叫IFB-088。

       Bertolotti博士隨后將她的平臺用于發(fā)現與非催化區域結合的PPP抑制劑。在今年早些時(shí)候發(fā)布在《Cell》上的研究中，她證明PPP的全酶可以在表面等離子共振芯片上組裝，它們可以用于篩選結合化合物。而使用相關(guān)的全酶進(jìn)行反向篩選可以去除那些沒(méi)有特異性的化合物。作為概念驗證，Bertolotti博士和她的同事發(fā)現了Raphin1，這是一個(gè)PPP1R15B的小分子抑制劑，它可能是治療亨廷頓病的候選藥物。

       Bertolotti創(chuàng )建了Camphos Therapeutics公司，使用同樣的篩選策略來(lái)發(fā)現其它PPP全酶的特異性抑制劑。與PTP相比，PPP調控幾乎所有的生物過(guò)程，因此具有更大的治療潛力。

       “我曾經(jīng)以為這是一個(gè)瘋狂的挑戰，我在嘗試一個(gè)不可能完成的任務(wù)，”當Bertolotti博士回顧最初研究PPP家族蛋白的決定時(shí)說(shuō)：“但是我是生物化學(xué)家出身，能夠研究一類(lèi)我們一無(wú)所知的蛋白酶絕對是非常讓人著(zhù)迷的事。”