精準腫瘤學(xué)的關(guān)鍵目標是改善癌癥的診斷和治療。而對腫瘤樣本的一系列基因組和其它分子分析能夠幫助發(fā)現標志物來(lái)幫助選擇療法，預測預后，跟蹤腫瘤進(jìn)化，以及發(fā)現不同轉移性疾病的分子特征。基于下一代基因組測序（NGS）的分子分析方法已經(jīng)在腫瘤分析方面得到應用，而綜合DNA、RNA、蛋白質(zhì)和表觀(guān)遺傳特征的多參數綜合分析可能更準確地描述腫瘤特征并且幫助發(fā)現全新成藥靶點(diǎn)。

       目前，精準腫瘤學(xué)的焦點(diǎn)愈發(fā)轉向液體活檢，因為它不具侵襲性，而且可以在不同時(shí)間點(diǎn)重復進(jìn)行，從而幫助監察疾病的進(jìn)展。如今，外周血液中可以被檢測的分析物（analyte）包括循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）；循環(huán)無(wú)細胞DNA（cfDNA），在癌癥患者中它包含循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）。其它分析物物包括循環(huán)無(wú)細胞RNA（cfRNA）；細胞外囊泡（EVs），例如外泌體和腫瘤“教育”的血小板（TEPs）；蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物。近日，《Nature Reviews Genetics》 對在精準腫瘤領(lǐng)域液體活檢的現狀和未來(lái)進(jìn)行了盤(pán)點(diǎn)，在今天的這篇文章里，藥明康德的微信團隊將與讀者分享這篇綜述的精彩內容。

       ctDNA作為生物標志物的利與弊

       ctDNA檢測是目前市場(chǎng)上最常見(jiàn)的液體活檢形式，它在具備巨大潛力的同時(shí)，在檢測開(kāi)發(fā)和臨床應用的推廣方面也面對著(zhù)一系列挑戰。

       ctDNA作為精準腫瘤學(xué)生物標志物的潛力

       研究表明，ctDNA可能由凋亡細胞釋放，因此，它只代表了腫瘤細胞的一種特定亞群。盡管如此，ctDNA具有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)：

       1. 它能夠提供對腫瘤基因組的綜合描述，因為ctDNA從多個(gè)不同腫瘤區域或多個(gè)病灶處釋放，ctDNA分析可以發(fā)現組織活檢中無(wú)法發(fā)現的體細胞突變。

       2. 深度測序可以發(fā)現腫瘤內異質(zhì)性和只在部分細胞中出現的基因突變。這通常需要大量的CTCs或者多次組織活檢才能獲得同樣水平的信息。

       3. ctDNA可以提供腫瘤大小的信息，從而反映出疾病的發(fā)展狀態(tài)和對療法的反應。研究發(fā)現，在非小細胞肺癌（NSCLC）和高級別漿液性卵巢癌（HGSOC）中ctDNA的突變等位基因頻率（VAF）與腫瘤體積呈線(xiàn)性關(guān)系。

       4. ctDNA還具備預測預后的價(jià)值。例如，在旨在治愈的手術(shù)或化療之后，ctDNA的出現是癌癥復發(fā)和不良預后的有力標志。它預測癌癥復發(fā)的能力在結腸癌、卵巢癌、肺癌和乳腺癌患者中都得到了驗證。

       5. ctDNA分析能夠發(fā)現腫瘤抗性的標志物，例如，在接受抗EGFR療法的結直腸癌患者中出現的KRAS突變，以及在乳腺癌患者中的PIK3CA、MED1、或EGFR上VAFs的升高。

       這些優(yōu)點(diǎn)讓ctDNA成為精準腫瘤學(xué)應用方面前景看好的分析物。然而ctDNA檢測也需要克服血漿中ctDNA水平過(guò)低，細胞衰老帶來(lái)基因變異的影響等挑戰。

       ▲組織活檢與ctDNA檢測特點(diǎn)對比（圖片來(lái)源：參考資料[1]）

       血漿中低水平ctDNA帶來(lái)的挑戰

       在血漿cfDNA中檢測到基因突變的能力與腫瘤負擔有對應的關(guān)系。但是在不同患者身上的ctDNA水平可能相差很大，雖然他們患上同樣類(lèi)型的癌癥。即使是在轉移性癌癥患者中，也有很大一部分患者血漿中ctDNA的比例異常的少。這清楚地表明，除了腫瘤負擔以外，還有其它生物因素影響腫瘤DNA的釋放。

       據估算，1毫升血漿中含有大約1500個(gè)基因組當量（GE）的DNA片段，通常一次10毫升抽血可以從血樣中獲得4毫升血漿，意味著(zhù)能夠獲得6000 GE的DNA片段。在VAF為0.1%的情況下，在這6000 GE的DNA片段中，平均只有6個(gè)DNA分子攜帶著(zhù)想要檢測到的基因突變，而且隨機取樣可能會(huì )影響這一數值。因此，可靠、準確并且可重復地檢測到這些基因突變是一個(gè)嚴峻的挑戰。

       檢測低水平ctDNA的方法

       如果增加血樣體積，可以檢測到的分子數目自然會(huì )顯著(zhù)上升，但是多抽血的辦法通常在晚期癌癥患者中無(wú)法實(shí)現。另外一種克服攜帶基因突變的分子數目過(guò)少的方法是同時(shí)檢測多種基因突變，然后確定一個(gè)基因突變數目的閾值來(lái)決定血漿樣本是否為腫瘤陽(yáng)性。例如，有的液體活檢可以同時(shí)檢驗患者是否攜帶18種單核苷酸位點(diǎn)變異（SNV），如果檢測到的SNV數目超過(guò)2個(gè)，則將ctDNA樣本定義為腫瘤陽(yáng)性。

       近年來(lái)ctDNA檢測技術(shù)的開(kāi)發(fā)主要聚焦于增強測序技術(shù)的分析敏感度。測序技術(shù)的敏感度會(huì )受到測序準確性和測序深度的影響。通過(guò)使用分子條形碼標記被測序的DNA片段，可以提高測序的準確性，從而提高發(fā)現基因突變的幾率。

       另一種提高敏感度的嘗試是富集特定長(cháng)度的ctDNA片段。有研究表明ctDNA 片段（132-145個(gè)堿基對）通常比健康細胞釋放的cfDNA片段（~166堿基對）小。因此，富集特定大小的DNA片段進(jìn)行測序可能提高發(fā)現基因突變的敏感度。

       ▲影響循環(huán)無(wú)細胞DNA檢測敏感度的因素（圖片來(lái)源：參考資料[1]）

       細胞衰老對ctDNA檢測的限制

       雖然這些技術(shù)的進(jìn)步能夠改善發(fā)現低VAF基因突變的能力，但是衰老細胞積累的體細胞突變也會(huì )對ctDNA的實(shí)用性添加限制。其中一個(gè)重要的干擾因素是良性體細胞基因突變隨著(zhù)細胞衰老而增加。在成人干細胞中出現的良性基因突變會(huì )隨著(zhù)細胞增殖傳給下一代，有的時(shí)候在腫瘤驅動(dòng)基因中出現的基因突變會(huì )導致攜帶這些突變的干細胞增殖速度更快，這可能被誤認為腫瘤增生。因此，在腫瘤驅動(dòng)基因中發(fā)現基因突變并不等同于發(fā)現癌癥。

       ctDNA檢測的分析效度和臨床有效性仍需確認

       在臨床護理中采納腫瘤生物標志物檢測的原則有三條：1. 分析效度（analytical validity），指的是檢測的準確性、可靠性和可重復性；2. 臨床有效性（clinical validity），指的是檢測能夠把患者分為不同群體，而且這些群體會(huì )有不同臨床后果的能力；3. 臨床實(shí)用性（clinical utility），指的是接受檢測的患者的臨床后果與未接受檢測的患者相比，是否有所改善。

       目前，市場(chǎng)上的ctDNA 檢測的結果一致性和臨床有效性還未得到完全確認。有研究使用兩種不同的ctDNA檢測方法對同一批樣本進(jìn)行檢測，試驗結果表明，在34個(gè)接受檢測的樣本中，只有9個(gè)樣本在兩種ctDNA檢測中給出了完全一致的結果。這種數據讓人對這些檢測的分析效度和臨床有效性產(chǎn)生疑慮。目前，業(yè)界需要進(jìn)行多中心研究，使用足夠大的患者群來(lái)確認ctDNA檢測的分析效度和臨床有效性。

       而且，檢測的標準操作程序和指導需要得到統一。歐洲標準化委員會(huì )（CEN）已經(jīng)發(fā)布了處理和紀錄用于ctDNA分析的血樣的標準程序。其它國際組織也在致力于將液體活檢的流程標準化。如果想將基于NGS的液體活檢在臨床中廣泛推廣，它們必需接受完備的檢驗并且通過(guò)基于確認標準的質(zhì)量檢測。

       新興的液體活檢分析方法

       以精準腫瘤學(xué)的需求來(lái)看，現有的液體活檢技術(shù)還存在很多不足。但通過(guò)擴大信息獲取與檢測的范圍，我們有望實(shí)現液體活檢技術(shù)的真正潛力。在這一段中，我們也將介紹目前新興的一些液體活檢方法。

       1. 組織與癌癥特異的DNA甲基化模式分析

       在表觀(guān)遺傳學(xué)中，CpG的甲基化是基因表達和組織分化的重要調控方式。近年來(lái)，隨著(zhù)人們對組織特異甲基化組學(xué)的了解不斷加深，通過(guò)分析甲基化的模式，我們可以推斷出cfDNA的組織來(lái)源，檢測癌癥。由于在癌癥發(fā)病初期，DNA就會(huì )出現甲基化修飾的變化，該技術(shù)有望在早期就協(xié)助醫生做出癌癥診斷。這一理念已經(jīng)在實(shí)驗中得到了驗證——2017年的兩篇論文表明，我們有望在乳腺癌和卵巢癌得到臨床確診的2年前，就在外周血液中檢測出腫瘤特異的甲基化變化。但這一技術(shù)目前也存在著(zhù)瓶頸，主要難點(diǎn)在于獲取足夠數量的循環(huán)腫瘤細胞，以及對于單細胞甲基化模式的分析。

       2. 核小體位置分析

       血液中cfDNA的主要形式是受單個(gè)核小體保護（mononucleosomal protected）的DNA。和甲基化模式類(lèi)似，來(lái)自不同細胞的cfDNA，其核小體所處的位置也有所不同。因此通過(guò)對這些核小體位置的分析，我們也能推導出cfDNA的來(lái)源。

       3. miRNA分析

       在生物學(xué)研究中，循環(huán)RNA在RNA-seq，qPCR，以及microarray等方面有著(zhù)多樣的應用。在諸多RNA內，miRNA由于其在血漿或血清中的穩定性得到了廣泛的關(guān)注，也有不少人期望能將其開(kāi)發(fā)成有用的診斷工具。舉例來(lái)講，有些科學(xué)家希望能使用低劑量計算機斷層掃描（low-dose computed tomography ，LDCT）技術(shù)，在高風(fēng)險的個(gè)體中對肺癌進(jìn)行早期檢測。而miRNA的評估有望減少LDCT技術(shù)較高的假陽(yáng)性率。一些研究表明，miRNA與LDCT技術(shù)的結合，能將后者的假陽(yáng)性率減少5倍！

       4. 分析細胞外囊泡的轉錄組和基因組

       細胞外囊泡是核酸與蛋白質(zhì)的載體，在細胞與細胞，乃至器官與器官間的交流中起到了重要作用。從運輸能力上看，細胞外囊泡最多能運載近100個(gè)蛋白質(zhì)和約10kb長(cháng)的核酸。在核酸方面，miRNA大約占了40.4%，piwi-互作RNA占了約40%，剩下的則是假基因（pseudo genes），lncRNA，tRNA，以及mRNA。這些RNA分子中的信息有望用于確認癌癥起源，做出早期診斷。除了核酸分子外，細胞外囊泡上的一些粘附分子（如整合素）也能用于推斷器官特異的癌癥轉移。

       值得一提的是，外泌體（exosome）可以由活性癌細胞直接分泌。與ctDNA進(jìn)行配合，可以從多個(gè)角度展示腫瘤的生物學(xué)特征，做出更準確的診斷。當然，健康組織也會(huì )分泌大量外泌體，其中的遺傳物質(zhì)也會(huì )帶有變異。因此在臨床應用上，我們還需要更好地對外泌體的行動(dòng)進(jìn)行追蹤。

       5. 經(jīng)過(guò)腫瘤“教育”的血小板

       腫瘤細胞有時(shí)會(huì )將生物分子轉移到血小板上，這個(gè)過(guò)程也被形象地稱(chēng)為“教育血小板”。有趣的是，這些信息可以被用于區分癌癥患者。在一項研究中，科學(xué)家們收集了228個(gè)癌癥樣本，而對于這些經(jīng)過(guò)腫瘤“教育”的血小板進(jìn)行RNA-seq，科學(xué)家們可以將局部和轉移癌癥患者與健康人區分開(kāi)來(lái)，準確度達84%-96%。區分腫瘤來(lái)源的準確度也達到了71%。這是因為不同的癌癥類(lèi)型，會(huì )把不同的分子帶給血小板。當然，這一技術(shù)目前還停留在較初步的階段。為了讓它得到更好的應用，我們還需要了解腫瘤“教育”血小板的具體過(guò)程。

       6. 蛋白質(zhì)分析

       細胞的正常運作離不開(kāi)蛋白質(zhì)，而許多疾病的根源正是蛋白質(zhì)的突變。然而除了PSA（前列腺特異抗原）外，目前臨床上我們能使用的蛋白標志物少之又少，且大多無(wú)法區分其來(lái)自哪些組織或癌癥。蛋白質(zhì)組學(xué)的蓬勃發(fā)展給了人們契機，讓我們建立了高質(zhì)量的蛋白關(guān)聯(lián)性圖譜。目前，我們已經(jīng)可以利用這些技術(shù)，明顯提高液體活檢在早期癌癥中的檢測率。

       7. 代謝物分析

       腫瘤的生長(cháng)發(fā)育往往會(huì )影響到人體生理上的變化，尤其是全身的代謝狀況。對于腫瘤來(lái)說(shuō)，它們能肆意改變自己的代謝通路，而血液中的代謝產(chǎn)物可能會(huì )成為有用的癌癥標志物。目前比較為人熟知的一個(gè)案例是BCAA，它能預示腫瘤發(fā)育早期對代謝調控的干擾——胰 腺癌的發(fā)病早期，BCAA水平會(huì )有所上升。而在非小細胞肺癌里，BCAA的水平則會(huì )下降。這些結果表明代謝物的組成可能成為液體活檢的重要部分。

       8. 活性循環(huán)腫瘤細胞分析

       近年來(lái)，單細胞分析技術(shù)有了飛躍式的發(fā)展，這也讓科學(xué)家們得以更為詳細地分析循環(huán)腫瘤細胞內的基因組、轉錄組、蛋白質(zhì)、以及表觀(guān)遺傳組信息。其中，來(lái)自活性循環(huán)腫瘤細胞的信息對于評估癌癥轉移有著(zhù)重要的作用。除此之外，這些細胞也能被用來(lái)建立患者特異的腫瘤模型。但首先，我們還需要解決不同癌癥種類(lèi)中循環(huán)腫瘤細胞的豐度問(wèn)題。比如非小細胞肺癌就很少會(huì )帶來(lái)循環(huán)腫瘤細胞。

       液體活檢技術(shù)面臨的挑戰

       任何一項技術(shù)在剛剛邁入應用之際，總是充滿(mǎn)了挑戰，液體活檢也不例外。盡管有多種新興分析方法不斷涌現，但這一技術(shù)的發(fā)展前方依舊充滿(mǎn)挑戰。

       1.真正理解血漿成分

       關(guān)于液體活檢的爭議之一，在于我們是否真正了解了血漿成分。舉例來(lái)講，過(guò)去人們認為ctDNA主要來(lái)自凋亡的癌細胞，但最近對ctDNA的一些分析卻找到了一些和癌細胞增殖有關(guān)的變化，刷新了認知。因此為了更好地理解細胞如何將DNA釋放到循環(huán)系統中，我們還需要更深入地了解健康人與癌癥患者中，血漿的組分與各個(gè)組織之間是怎樣的一個(gè)關(guān)系。截止到目前，我們做的還非常不夠。

       舉例來(lái)說(shuō)，不少關(guān)于組織特異性的研究，其專(zhuān)注的只有少數集中細胞類(lèi)型，探索血漿cfDNA來(lái)源的研究也寥寥無(wú)幾。這容易給分析帶來(lái)偏差——不少研究指出白血球是循環(huán)核酸的主要來(lái)源，占比范圍在42%-90%。然而最近的一項研究卻發(fā)現，幼紅細胞來(lái)源的DNA在健康人里，中位占比大概是30.1%，而這是先前人們從來(lái)沒(méi)有報道過(guò)的組織來(lái)源。可想而知，不同的分析方法得出的結論究竟有多大的區別，這也反映了我們對于血漿cfDNA組成的無(wú)知。

       2. 液體活檢與免疫腫瘤學(xué)

       液體活檢與免疫腫瘤學(xué)的交織，是最近的研究熱點(diǎn)之一。當循環(huán)腫瘤細胞離開(kāi)原發(fā)腫瘤之后，就會(huì )暴露在免疫監控之下。因此，它們也需要一定的免疫逃逸機制才能生存。目前我們已經(jīng)知道，這些循環(huán)腫瘤細胞有能力改變自己的MHC I呈遞、改變NK細胞配體表達、或是下調FAS/FASL的表達。理解這些變化，有助于免疫腫瘤學(xué)的發(fā)展。

       通過(guò)對循環(huán)腫瘤細胞進(jìn)行液體活檢，還能帶來(lái)實(shí)際的應用價(jià)值。最近，人們通過(guò)抗PD-L1抗體，發(fā)現在這些細胞上也有PD-L1的表達。這些信息可以用于患者細分。

       此外，我們還能通過(guò)分析ctDNA里的腫瘤突變負擔（TMB），了解檢查點(diǎn)抑制劑的潛在效果。這是因為T(mén)MB越高，產(chǎn)生新抗原的幾率就越高。一些研究也表明，TMB能用來(lái)找到哪些患者在免疫療法的治療后，在臨床上能有更好的預后。

       3. 對多種參數的測量與整合

       如果要給液體活檢展望一下未來(lái)，成功檢測最小殘留病灶可以說(shuō)是一個(gè)目標。最終，我們希望能在早期對癌癥進(jìn)行診斷。要實(shí)現這些目標，有時(shí)我們只需要檢測一個(gè)指標就夠了。最近，2017年藥明康德生命化學(xué)研究獎得主盧煜明教授領(lǐng)銜的一支團隊發(fā)現，只要在外周血液里檢測Epstein–Barr病毒的DNA，就能篩選出早期的鼻咽癌患者。許多專(zhuān)家認為這項研究堪稱(chēng)是里程碑。

       但更多的情況下，一個(gè)指標是遠遠不夠的。在涉及多個(gè)指標的案例中，我們還需要考慮參數整合的問(wèn)題。在最早的一些嘗試中，人們主要綜合的是ctDNA與蛋白標志物。舉例來(lái)說(shuō)，CA19-9、TIMP1、以及LRG1等蛋白標志物，輔以對KRAS基因突變的檢測，能夠找到腫瘤可切除的前列腺癌患者，且檢測率要高于只使用ctDNA的方法。

       最近，一種叫做CancerSEEK的早期癌癥檢測策略浮出水面。在一項招募了1005名志愿者，涉及8種常見(jiàn)癌癥類(lèi)型的臨床研究中，蛋白質(zhì)與遺傳標志物的組合，猜對癌種的中位正確率為70%。由于致癌基因突變未必具有組織特異性，想要區分癌癥的來(lái)源，還是要靠對蛋白質(zhì)的分析。但這種技術(shù)容易帶來(lái)假陽(yáng)性，且在早期癌癥的檢測中效果不佳。

       盡管如此，研究人員們依舊指出，通過(guò)整合不同標志物的分析結果，液體活檢的潛力看好。在前列腺癌與胰 腺癌的診療上，我們已取得了一些可喜的進(jìn)展。

       4. 機器學(xué)習遇上液體活檢

       人們也意識到，綜合考量多種指標需要較高的計算能力，而機器學(xué)習算法則有望自動(dòng)發(fā)現和檢測癌癥特異的指標，助力液體活檢。這可能涉及簡(jiǎn)單的邏輯回歸，也可能涉及復雜的多層人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )。

       事實(shí)上，機器學(xué)習技術(shù)已經(jīng)在液體活檢中取得了一些成績(jì)。比如利用深度學(xué)習的方法，我們能以更高的靈敏度和特異性去探測循環(huán)腫瘤細胞；用基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )的miRNA分析，我們可以區分健康女性和罹患卵巢癌的女性，特異性達。

       但目前利用機器學(xué)習算法的短板，在于獨立觀(guān)察數據的不足。該綜述指出，目前患者的樣本量一般在幾十到幾千之間，而按堿基的分辨率計算，單名患者就可能產(chǎn)生數百億的數據。在理想的情況下，設置機器學(xué)習算法時(shí)，前者應比后者的數量來(lái)得更多。比如經(jīng)典的圖像處理AI，處理的樣本高達數百萬(wàn)，而潛在的分析特征只有幾千，兩者的數量級之間有著(zhù)明顯的差距。在數據不足的前提下，機器學(xué)習算法可能會(huì )出現過(guò)度擬合。它能很好地解釋訓練數據，但無(wú)法用于新的數據。

       結語(yǔ)和展望

       液體活檢在腫瘤學(xué)方面的應用日益增多。然而，我們需要對液體分析物的產(chǎn)生機理和水平動(dòng)態(tài)進(jìn)行更深入的了解，同時(shí)需要確認液體活檢的臨床有效性和臨床實(shí)用性，這樣才能進(jìn)一步推廣液體活檢的臨床應用。

       目前，大多數檢測都只聚焦于一種分析物，然而將血液中存在的多種分析物的數據綜合起來(lái)構成的多參數檢測可能大幅度改善檢測的精確度和使用范圍。這些檢測技術(shù)的開(kāi)發(fā)需要使用創(chuàng )新統計工具，它們能夠使用多維機器學(xué)習方法來(lái)整合從一個(gè)樣本中獲取的大量數據。

       因此，未來(lái)的液體活檢研發(fā)將橫跨多個(gè)學(xué)科，包括基礎生物學(xué)和生理學(xué)、分子生物學(xué)、檢測技術(shù)、統計學(xué)和機器學(xué)習。非常關(guān)鍵的一點(diǎn)是，只有當液體活檢的臨床有效性和臨床實(shí)用性得到證明之后，這項技術(shù)才能發(fā)揮它全部的潛力，為基因組驅動(dòng)的腫瘤學(xué)和癌癥患者的臨床管理帶來(lái)重大影響。