問(wèn)世間誰(shuí)人無(wú)憂(yōu)，唯神仙逍遙自在。
作為一名終日泡在實(shí)驗室的實(shí)驗君，
如何在細胞實(shí)驗中無(wú)所不能，超脫輪回
做到一個(gè)人人羨慕的細胞大神呢？
且看向這里，成為細胞大神的六個(gè)細節。
1. 過(guò)濾體系
自從出現瓶裝培養基之后，培養基過(guò)濾的需求就減少了。有些時(shí)候，一些特定細胞培養支持物的添加可能會(huì )引入一些新的污染。另外，一般認為，當液體長(cháng)時(shí)間接觸瓶口外的空氣后重新過(guò)濾；所以一般不建議 管/瓶 對 管/瓶 的傾倒。這時(shí)，很多人會(huì )選擇Millipore的濾嘴配合針筒進(jìn)行再過(guò)濾。結果發(fā)現，完成500 ml培養基過(guò)濾后，手疼腰酸！過(guò)濾杯的出現完美的解決了這個(gè)問(wèn)題，所以，大體積盡量使用過(guò)濾杯吧，可靠且輕松，快捷。
默克第二代超濾杯
2. 培養基的選擇
關(guān)于血清質(zhì)量，業(yè)界流行的澳洲來(lái)源 > 北美來(lái)源 >南美來(lái)源的說(shuō)法。這一點(diǎn)從價(jià)格上也可見(jiàn)一斑。實(shí)際情況是優(yōu)質(zhì)血清的市場(chǎng)現實(shí)是供不應求，所以很多時(shí)候大家就將就了之。如果有好的選擇，盡量使用澳洲來(lái)源的血清。
對于培養基而言，情況顯然是供大于求的，而且品牌甚多：Sigma，Gibco，Hyclone以及各種國產(chǎn)培養基等，當然一些國外廠(chǎng)商基于競爭及成本的考慮也推出了本土化的培養基。一些人認為培養基能用就行，反正細胞就在那里長(cháng)著(zhù)，也沒(méi)出現大規模的傷亡就忽視了培養基的重要性。但是，實(shí)驗是對完美的追求，多處將就會(huì )導致結果的將就，得不償失！從細胞培養的實(shí)際表現（活力，增殖周期，狀態(tài)等）看，原裝進(jìn)口培養基 > 進(jìn)口分裝培養基 > 大部分國產(chǎn)培養基。所以，別再將就培養基了！
如果是因為價(jià)格原因而放棄原裝進(jìn)口培養基，現在好的機會(huì )來(lái)了。Merck/Sigma推出原裝進(jìn)口培養基國產(chǎn)價(jià)格，覆蓋幾乎全部基礎培養基。
3. 支原體檢測
支原體污染和細胞培養機會(huì )形影不離，堪稱(chēng)細胞培養的惡夢(mèng)。前些年有報道說(shuō)全球超過(guò)60%的實(shí)驗室的細胞存在細胞污染的現象。從早期表現看，支原體污染會(huì )讓你感覺(jué)不到，可能僅僅是細胞增速有些減緩；于是還是快樂(lè )的做的實(shí)驗，結果實(shí)驗數據不是很理想。事實(shí)是，支原體污染會(huì )影響細胞代謝，改變細胞功能等。
藥典檢測支原體是培養法，時(shí)間以周記，這顯然不符合科研”快”的需求。PCR法應運而生，Sigma的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit，擴增的是支原體基因組上16S核糖體RNA基因。此區域高度保守，因此可檢測多達19種支原體。但是PCR后的電泳也是一件麻煩的事情，qPCR就是解決方案：LookOut Mycoplasma qPCR Detection Kit。
LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit實(shí)際效果
4. 胰酶的使用
胰酶適合大部多數細胞的消化：HEK293，CHO，HeLa等，而這類(lèi)細胞我們往往將他定義為“糙”。當然，細胞本身肯定是不糙的，同樣相當金貴。只不過(guò)這些細胞對胰酶的耐受性好，一定濃度下的胰酶對細胞狀態(tài)影響不大。
有些細胞就非常金貴了，堪稱(chēng)“嬌嫩”，比如：干細胞/">干細胞等，就不太適合利用胰酶進(jìn)行消化。另外，如果消化組織進(jìn)而分離細胞時(shí)使用胰酶也是值得小心的。一個(gè)好的解決方案是尋找一些溫和的替代品：Accutase、Accumax或EZ-LIFT。這些消化劑劑的特點(diǎn)是可替代胰酶，消化后無(wú)需用血清失活。尤其是EZ-LiFT?干細胞/">干細胞傳代試劑，這是一種無(wú)酶、化學(xué)成分限定的干細胞解離試劑，只選擇性傳代未分化的多能干細胞，避免人工進(jìn)行群落篩選或細胞刮鏟的步驟，不需要使用ROCK抑制劑即可產(chǎn)生高細胞活性，還可以拯救高度分化的ips細胞培養物。
5. 細胞計數
細胞計數是細胞培養的日常。血球計數器、載破片、蓋玻片的組合折磨的每一個(gè)技術(shù)者的眼睛及耐心。所幸的是，一些公司根據血球計數的原理開(kāi)發(fā)出了自動(dòng)的計數儀，插入裝有細胞的蓋玻片即可。事實(shí)上，基于血球計數原理的另外一個(gè)問(wèn)題是計數的準確性。一般認為CV可能在20%以上，這就非常糟糕了，打算加入10000個(gè)細胞，很可能計入了15000個(gè)細胞，這是絕對不能接受的。
另外一個(gè)計數方法是基于庫爾特原理---類(lèi)似與流式的方法，將細胞挨個(gè)數一遍。看到這個(gè)，可能想得是：這么大的一起，這么麻煩怎么做日常計數？Merck的做法是將這個(gè)設備小型化了：Sceptor，整體和一把1 ml移液槍類(lèi)似。15秒內完成細胞技術(shù)且CV小于5%。
細胞計數器Sceptor及其數據呈現形式
6. 細胞凍存
細胞傳代過(guò)程中涉及細胞凍存。這么說(shuō)其實(shí)是很有歧義的，嚴格意義上說(shuō)獲得細胞系完成檢測后第一件事就是大批量?jì)龃婕毎箝_(kāi)始進(jìn)行該細胞相關(guān)實(shí)驗。常規來(lái)說(shuō)，一株細胞的使用周期不宜過(guò)長(cháng)，這樣能排除反復傳代過(guò)程中細胞生物學(xué)特性的改變。所以，很多時(shí)候他人惠贈的細胞系可能會(huì )存在傳代過(guò)多的問(wèn)題，一個(gè)好的方案是從ATCC或ECACC（歐洲細胞庫）購買(mǎi)細胞，這些平臺的細胞背景干凈，傳代次數少。
DMSO是最常用的細胞凍存保護劑，市面上品牌眾多，質(zhì)量參差不齊。如果使用劣質(zhì)DMSO凍存細胞，可能從實(shí)驗的第一步開(kāi)始就已經(jīng)出了細胞品質(zhì)不好的問(wèn)題。推薦使用Sigma的DMSO，較多細胞凍存驗證的；或者直接使用其DMSO無(wú)血清細胞凍存培養基，確保細胞贏(yíng)在起跑線(xiàn)。
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