無(wú)需病毒載體，實(shí)現對人類(lèi)T細胞高效、精準的基因改造，這是科學(xué)家們最新發(fā)表在Nature雜志上的突破成果。而“魔剪”CRISPR又在其中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。研究人員認為，這一成果對科研、醫學(xué)和工業(yè)領(lǐng)域具有重大意義，將大大加快下一代細胞療法的發(fā)展，為癌癥等疾病的治療帶來(lái)新希望。
病毒引發(fā)感染是通過(guò)注射它們自己的遺傳物質(zhì)。自上世紀70年代以來(lái)，科學(xué)家們就已經(jīng)開(kāi)始運用病毒的這一特性：利用病毒載體運送DNA到細胞中，用于研究、基因療法等。
然而，構建病毒載體其實(shí)是一個(gè)非常艱苦、昂貴的過(guò)程，臨床級載體（clinical-grade vectors）的短缺還導致了基因療法和細胞療法的生產(chǎn)瓶頸。此外，即使是可用的，病毒載體也遠不是一種理想的工具，因為它們會(huì )將基因隨意插入到細胞基因組中，這將損害現有的健康基因或使新引入的基因不受確保細胞正常運作的調節機制的控制。這些局限性可能會(huì )導致嚴重的副作用，已經(jīng)引起了人們對基因療法和細胞療法（如CAR-T）的擔憂(yōu)。
擺脫“病毒”的新技術(shù)
7月11日，發(fā)表在Nature雜志上題為“Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting”的研究中，來(lái)自加州大學(xué)舊金山分校（UCSF）的科學(xué)家們開(kāi)發(fā)出了一種在不使用病毒插入DNA的前提下就能“重寫(xiě)”人類(lèi)T細胞基因組的強大技術(shù)。
具體來(lái)說(shuō)，該技術(shù)依賴(lài)于電穿孔：將一個(gè)電場(chǎng)應用于細胞，使得細胞膜暫時(shí)具有更大的滲透性。經(jīng)過(guò)一年的探索，UCSF的Alex Marson博士帶領(lǐng)的團隊發(fā)現，當一定數量的T細胞、DNA和CRISPR被混合在一起，然后暴露于適當的電場(chǎng)后，T細胞能夠精準整合特定的基因序列到基因組中被CRISPR切割的位點(diǎn)。
Alex Marson, MD, PhD, UCSF immunologist whose group has developed an approach to edit T cell genomes without using viruses, speaks with MD/PhD student Theo Roth. Credit: Noah Berger.
事實(shí)上，Marson博士實(shí)驗室的成員先前已經(jīng)在利用電穿孔和CRISPR插入少量遺傳物質(zhì)到T細胞中取得了一定程度的成功。但大量嘗試將長(cháng)的DNA序列插入到T細胞中的實(shí)驗都失敗了：導致了細胞死亡。這使得很多研究人員認為，大的（長(cháng)的）DNA序列對T細胞**過(guò)大。
為了展示新技術(shù)的多功能性和實(shí)力，Marson博士等利用它修復了T細胞中的一種致病基因突變，并且創(chuàng )造出了能夠找到和殺死人類(lèi)黑色素瘤細胞的“定制T細胞”。
據論文第一作者Theodore L. Roth介紹，科學(xué)家們嘗試將新基因插入T細胞已有30年之久。在他們的研究中，經(jīng)過(guò)近一年的反復試驗，Roth確定了T細胞數量、DNA數量和CRISPR豐度（CRISPR abundance）的比值，結合擁有適當參數的電場(chǎng)，實(shí)現了對T細胞基因組高效、準確的編輯。
The research team created CRISPR guides that would cause green fluorescent protein to be expressed in only certain cellular locations and structures. Credit: Alex Marson's Lab.
“實(shí)力”驗證
研究中，Roth首先設計CRISPR用綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標記一組不同的T細胞蛋白，結果證實(shí)，新技術(shù)具有高度的特異性，且脫靶效應水平非常低：GFP只在特定的細胞位置和結構中表達。
接著(zhù)，他們開(kāi)始驗證新技術(shù)的治療前景。在第一個(gè)實(shí)驗中，Roth及其同事使用了由耶魯醫學(xué)院Kevan Herold提供給Marson博士實(shí)驗室的T細胞。這些細胞來(lái)自患罕見(jiàn)、嚴重自身免疫性疾病的三個(gè)兄弟姐妹。基因組測序顯示，這些兒童的T細胞攜帶著(zhù)IL2RA基因的突變。而IL2RA基因編碼的是對調節性T細胞（Tregs，可抑制其他免疫細胞，阻止自身免疫）發(fā)育至關(guān)重要的一種細胞表面受體。
利用基于CRISPR的新技術(shù)，UCSF的團隊快速修復了兒童T細胞中的IL2RA缺陷，以及因突變受損的細胞信號。研究人員希望，就像利用CAR-T療法抗癌一樣，類(lèi)似的技術(shù)能夠有效治療自身免疫性疾病。
在第二個(gè)實(shí)驗中，借助新技術(shù)，科學(xué)家們用“被專(zhuān)門(mén)設計用于識別人類(lèi)黑色素瘤細胞特殊亞型的新受體”完全取代了“正常人類(lèi)T細胞中的天然T細胞受體（T cell receptors，細胞用于檢測疾病和感染的傳感器）”。在培養皿中，被改造過(guò)的T細胞表現出了特異性：不僅能夠有效地找到目標黑色素瘤細胞，同時(shí)還會(huì )忽略其他細胞。這對于癌癥精準治療是非常重要的。
研究人員強調，在不使用病毒載體的情況下，他們能夠生產(chǎn)出大量經(jīng)CRISPR改造后表達新T細胞受體的工程細胞。而將這些CRISPR工程細胞（CRISPR-engineered cells）移植給攜帶人類(lèi)黑色素瘤的小鼠后，它們能夠進(jìn)入腫瘤部位，并顯示出抗癌活性。
Set of test tubes in Alex Marson's lab. Credit: Noah Berger.
前景廣闊
Roth表示，由于新技術(shù)使得“在一周多一點(diǎn)的時(shí)間內創(chuàng )建可用的定制T細胞系”成為了可能，因此，它已經(jīng)改變了Marson博士實(shí)驗室的研究環(huán)境。先前一些受限于病毒載體的實(shí)驗現在可以進(jìn)行了。
“這是一種能夠用于改變、增強以及重編程T細胞的快速、靈活的方法。與速度和易用性一樣重要的是，新技術(shù)使得‘將大量的DNA片段插入T細胞中’成為了可能，這將賦予T細胞強大的新特性。”Marson博士評價(jià)道。
總結來(lái)說(shuō)，研究人員希望，他們的新技術(shù)——一種基于CRISPR的快速、全能、經(jīng)濟的方法能夠在新興的細胞治療領(lǐng)域得到廣泛應用，加速開(kāi)發(fā)新的、更安全的癌癥、自身免疫性疾病和其他疾病（包括罕見(jiàn)的遺傳性疾病）的治療方法。
參考資料：
T Cell Engineering Breakthrough Sidesteps Need for Viruses in Gene-Editing——With Faster, Cheaper, More Precise Technique, Authors Say It’s ‘Off to the Races’ Toward New Cell Therapies
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