題記

        記得，同位素、同位素標記這些詞匯首次被輸入進(jìn)大腦，可追溯到少時(shí)學(xué)習“光合作用”的年代...是啊，我們曾經(jīng)學(xué)了那么多東西，真正能用到日后工作中的，又能有多少？而這眾多的“知識點(diǎn)”，倘若能在日后有所接觸，就已經(jīng)十分不易了...曾經(jīng)的同位素標記，告訴了我們“光合作用中釋放的氧到底是來(lái)自于水，還是來(lái)自于二氧化碳”，而今天工作中的同位素示蹤，又能告訴我們哪些信息呢？而我們又需要了解哪些與藥物相關(guān)的同位素信息呢？筆者作為一名藥物合成人員，作了如下歸納總結，希望能對君有益！

        同位素簡(jiǎn)介

        同位素為相同化學(xué)元素的原子，由于在原子核中存在不同的中子數而具有不同的質(zhì)量，有輕、重同位素之分；根據物理特性，又可將同位素分為**和穩定性?xún)煞N形式。**同位素(如：³H、¹⁴C)經(jīng)歷著(zhù)自身的衰變過(guò)程，并放射出輻射能，是不穩定的，具有物理半衰期；穩定性同位素無(wú)**，物理性質(zhì)穩定，以一定比例(豐度)存在于自然界，對人體無(wú)害，可采取化學(xué)合成的方法將其標記到藥物分子中去，并通過(guò)氣質(zhì)、液質(zhì)等儀器對其進(jìn)行跟蹤檢測。

        “同位素標記”在藥物研發(fā)過(guò)程中的2個(gè)主要方向

        &藥代動(dòng)力學(xué)研究

        在定量分析靈敏度方面，**同位素標記化合物要高于穩定同位素標記物，且**的測量不受非**雜質(zhì)和化學(xué)狀態(tài)的影響，因此定量分析更加簡(jiǎn)便，分析結果更加準確。**同位素標記化合物除了用于解決常規分析方法無(wú)法解決的分析難題，更重要的是可用作示蹤劑，從而來(lái)研究藥物在體內的分布、代謝、療效、作用機制等，為藥物的藥代動(dòng)力學(xué)研究提供重要的依據，同時(shí)為創(chuàng )新藥物的研發(fā)提供方法。

        &**研究

        潛在**研究是藥物的發(fā)現和臨床過(guò)程中必須進(jìn)行的一個(gè)環(huán)節，以往的**研究多采用對大量的化合物進(jìn)行體外實(shí)驗和動(dòng)物實(shí)驗，需要花費大量的金錢(qián)和時(shí)間，且對**產(chǎn)生的機理也無(wú)法解釋。使用穩定同位素標記的化合物可以追蹤藥物的代謝過(guò)程，找出**產(chǎn)生的原因，并能預測新化合物潛在的**。

         “放射”VS“穩定”簡(jiǎn)述

         &**同位素標記

         **同位素得以廣泛應用于活性物質(zhì)示蹤主要依賴(lài)于其最重要的兩個(gè)特點(diǎn)：1)是與被示蹤的物質(zhì)有同一性，即**核素與其同種元素的非**核素在化學(xué)和生物學(xué)行為上具有高度一致性，不致擾亂和破壞體內外生理過(guò)程的平衡狀態(tài)；2)是與被示蹤的物質(zhì)有可區別性，**核素的原子核不斷衰減，發(fā)出能被**探測儀所探測的射線(xiàn)，從而實(shí)現對標記物的定量及定位。此外，**同位素示蹤技術(shù)還具有靈敏度高、專(zhuān)屬性強、適用性廣、檢測方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，因此在藥物ADME研究中得到了廣泛的應用，且美國FDA早已將**同位素標記藥物給藥后的藥動(dòng)學(xué)數據作為新藥安全性評價(jià)的重要依據，并制定了相關(guān)指南。

         &穩定性同位素標記

         穩定同位素標記試劑較**同位素標記試劑而言，最主要的優(yōu)點(diǎn)在于無(wú)**、無(wú)需復雜的放化設備及防輻射防護措施，且無(wú)環(huán)境污染。目前，在我國國內已完成了¹⁵N、¹⁸O、²⁰Ne、²²Ne、¹³C等穩定同位素分離技術(shù)的研究，并逐步將穩定同位素標記試劑的制備和檢測技術(shù)進(jìn)行國產(chǎn)化研發(fā)，從而打破國外壟斷。

        示蹤劑如何選擇？

        &**同位素示蹤劑

        在藥物ADME的研究中，常用的**同位素包括¹⁴C、³H、³²P、³³P、³⁵S、125I 、¹³1I等。隨著(zhù)小型PET儀器的發(fā)展，利用¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸F等**核素進(jìn)行ADME研究的實(shí)例也日漸增多。在**示蹤劑的選擇上，應根據實(shí)驗目的、實(shí)驗周期以及操作者安全等幾方面綜合考慮，包括所選**同位素的射線(xiàn)類(lèi)型、半衰期、放射化學(xué)純度、比活度、**及標記位置等。常用的**示蹤劑多為單一**同位素標記的化合物，有時(shí)為了實(shí)驗的特殊需要，也可以采用雙標記或多標記的**物質(zhì)，但此時(shí)選用的標記原子是不同能量或發(fā)射不同類(lèi)型射線(xiàn)的核素。常見(jiàn)的有¹⁴C/³H、¹⁴C/¹²⁵I、¹²⁵I/¹³¹I等。

         低能量的¹⁴C和³H是藥物ADME研究中最常用的2種**核素，這2種核素的半衰期分別為5730年和12.35年，由于其半衰期長(cháng)，在實(shí)驗周期中測得的數據一般不需要作物理半衰期的校正，便于測量及結果計算。再者，¹⁴C和³H兩種元素發(fā)射的β-射線(xiàn)能量較低，易于防護，并可用液閃技術(shù)測得，實(shí)驗操作及結果檢測十分方便。此外，¹⁴C和³H還可通過(guò)放射自顯影技術(shù)進(jìn)行檢測，顯影清晰，這又進(jìn)一步擴大了這2種核素的標記物在A(yíng)DME研究中的應用。

         &穩定性同位素示蹤劑

         藥學(xué)領(lǐng)域常用于示蹤的穩定性同位素，主要為²H、¹³C、¹⁵N、¹⁸O。嚴格來(lái)講，穩定性同位素是指某元素中不發(fā)生或極不易發(fā)生**衰變的同位素，如¹²C和¹³C均是碳的穩定性同位素，且在代謝研究中，“穩定性同位素”常用來(lái)表示天然豐度比較低的那一種穩定性同位素。碳在自然界中主要以12C的形式存在，13C僅占1.11%，氮元素則以¹⁴N為主，¹⁵N僅占0.37%。

         標記位置的選擇

         在制備標記藥物前，首先要選好合適的同位素作為標記元素并決定標記的位置。作為示蹤研究用的標記藥物要使標記的原子盡量能代表該藥物整個(gè)分子在生物體內的作用，并且要注意到藥物在體內可能發(fā)生的變化。在選用作為標記原子的同位素時(shí)應考慮到藥物分子的結構，同位素的半衰期，射線(xiàn)的能量，是否易把標記原子引入以及示蹤試驗的特殊要求等因素。最常用的同位素有¹⁴C、³H和³⁵S；有時(shí)也采用³²P、¹³¹I。

         ¹⁴C作為最常用的**核素通常標記在分子的骨架結構上，其標記位點(diǎn)較為穩定；³H易與周?chē)h(huán)境中的¹H發(fā)生交換，導致比活度下降，因此穩定性不如¹⁴C；此外，³H相對于¹⁴C來(lái)說(shuō)有較明顯的同位素效應，也在一定程度上限制了其應用。不過(guò)在一般的示蹤實(shí)驗中，由同位素效應引起的誤差常在實(shí)驗允許誤差內，可忽略不計。此外，考慮到³H標記物的合成較為簡(jiǎn)便，因此在3H標記物能夠滿(mǎn)足實(shí)驗需求的情況下，也常選用³H標記物作為示蹤劑。

         除以上，在標記位點(diǎn)的選擇時(shí)，還可利用計算機輔助代謝物預測技術(shù)(CAMP)預測化合物分子結構中的穩定部位。一般來(lái)說(shuō)，應首先考慮對分子結構中的芳香環(huán)或脂環(huán)上的C原子進(jìn)行標記，而盡可能避免在羧基、羥基、巰基、氨基、亞氨基等活性部位進(jìn)行標記。因為一旦這些不穩定基團脫離母體化合物，就失去了對母體藥物及主要代謝物的示蹤的能力。此外，標記位點(diǎn)還應遠離化學(xué)鍵斷裂位置，以避開(kāi)同位素效應的影響。如果母體化合物在代謝過(guò)程中因化學(xué)鍵斷裂同時(shí)生成2個(gè)重要代謝產(chǎn)物，在母體化合物標記時(shí)可考慮采取雙標記技術(shù)。

         同位素標記試劑的化學(xué)合成

        &放射同位素標記試劑的合成

         **化合物的合成制備，受限于其有限資源和高昂的費用，因此一般新藥進(jìn)入實(shí)質(zhì)性研發(fā)階段才采用**標記化合物進(jìn)行示蹤研究。**化合物在藥物研發(fā)中的應用多數傾向于限制在臨床前或臨床研究階段。而進(jìn)入臨床前和臨床研究階段之前的相關(guān)研究中通常可用直接氚化等新技術(shù)，如用氚水、氚氣、氚復合物以及近期發(fā)展起來(lái)的氚化試劑等目標化合物分子中直接引入氚原子，得到簡(jiǎn)單的非定位氚標記目標化合物，而不必進(jìn)行**合成方法進(jìn)行定位標記。此類(lèi)方法有一定缺陷，如在體內易于與體內的氫原子交換而導致原藥及其代謝產(chǎn)物失去**。但此類(lèi)非定位標記方法有著(zhù)**示蹤物易于標記，技術(shù)手段簡(jiǎn)單、經(jīng)濟等特點(diǎn)，而且足以完成新藥研究初期目標物質(zhì)在體內外大致定性和定量目的。但新藥研究后期，化合物在體內ADME研究、代謝動(dòng)力學(xué)研究及物料平衡研究等深入確切的定位定量，甚至進(jìn)一步進(jìn)行代謝產(chǎn)物的定性定量研究中需要穩定的定位標記化合物來(lái)完成。因此，用化學(xué)合成方法將新藥目標化合物中代謝穩定基團的C，H，I，F 等元素用¹⁴C，³H，¹²⁵I，¹⁸F等**元素進(jìn)行對應標記合成。標記合成一般采用含有**元素的簡(jiǎn)單化合物，如³H₂，¹⁴CO₂，Na¹²⁵I 等，在藥物合成的適當步驟中引入，并在制備操作、分離、分析時(shí)均需微量或超微量技術(shù)。

         &穩定同位素標記試劑的合成

         化學(xué)合成法合成穩定同位素標記有機或無(wú)機類(lèi)試劑通過(guò)選擇合適的合成路線(xiàn)，設計適合實(shí)驗室規模實(shí)施的精密合成裝置和高效催化劑以及特殊精制純化裝置的設計、制造，使得原本在工業(yè)條件下合成的多種穩定同位素標記試劑得以在實(shí)驗室的溫和條件下高收率、高質(zhì)量的完成制備。穩定同位素標記試劑的合成策略不僅要考慮純度和收率，更多的需要考慮工藝過(guò)程對目標產(chǎn)物豐度的影響。因此，需要根據目標產(chǎn)物的定位標記選擇合適的同位素原料，充分考慮合成環(huán)境對豐度影響因素等問(wèn)題。例如，有機合成法制備穩定同位素¹³C標記試劑，合成路線(xiàn)的設計、空氣中CO₂的影響、甚至設備材質(zhì)的成分都會(huì )對¹³C同位素的豐度產(chǎn)生明顯影響，在合成穩定同位素D標記試劑時(shí)，空氣中微量的水分可能會(huì )對目標化合物的豐度產(chǎn)生較大的影響，制備過(guò)程中用到的大量含H元素的無(wú)機或有機試劑，也可能會(huì )對合成的D標記試劑的同位素豐度造成稀釋。

        穩定同位素標記基礎試劑在穩定同位素標記試劑的化學(xué)合成中起著(zhù)關(guān)鍵和決定性作用。通常情況下，穩定同位素的基礎原料是 H₁₅NO₃、¹³CO和 D₂O，以有限的穩定同位素基本原料來(lái)合成穩定同位素標記基礎試劑，因而也就使得該類(lèi)試劑的合成難于普通試劑。如¹³C或D標記甲醇的制備，常規甲醇的制備已是非常成熟的工藝，采用中高壓反應設備和工藝，條件復雜、單程轉化率低，需將CO氣體循環(huán)利用來(lái)得到高收率和高純度的甲醇，這樣的工藝完全不適合¹³C或D標記甲醇的合成。¹³C或D標記甲醇的合成是通過(guò)設計精密的催化加氫反應器和精餾裝置，以¹³CO 或 D₂O為原料，添加自制的 Cu-Zn-Cr催化劑，采用精細控制的工藝條件，可使同位素原料的利用率達90%以上。又如¹⁵N標記水合肼的合成過(guò)程中，雖然參考了工業(yè)化水合肼的工藝過(guò)程，但為了提高穩定同位素原料尿素-¹⁵N2的利用率，除改變了反應所需的催化劑外，還對工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，從而使¹⁵N同位素利用率達75%以上。¹³C、D標記的乙炔、苯、碘 甲 烷是引入穩定同位素標記基團的重要基礎試劑，制備的基本原則不僅要考慮同位素基礎原料的充分利用，同時(shí)要考慮合成產(chǎn)物的同位素豐度要達到99 atom%以上。

         感悟

        之所以總結以上內容，源于最近項目的進(jìn)展。講真，新藥合成，這條路不易(當然，整個(gè)新藥研發(fā)鏈都不易...)。曾幾何時(shí)，藥物化學(xué)大部分工作都是在干化學(xué)，而如今，化學(xué)已僅僅成為了拿到目標化合物的一種手段而已。工作中，我們的精力不得不均分到各個(gè)學(xué)科當中(如藥理、毒理、質(zhì)量、制劑...)，否則，學(xué)科間相互討論的時(shí)候，就尷尬了，且不利于項目的整體了解與把控。不過(guò)，雖然每天焦頭爛額、腳打后腦勺的忙碌，但這條道路卻又能帶來(lái)分外的充實(shí)，因為它不僅可以離科學(xué)更近一些，且倘若開(kāi)花結果，是可以為無(wú)數的病患帶來(lái)健康和希望的。故每當想到于此，努力讓自己成為一名傳承中的“種樹(shù)人”，再苦再累，又有何不可呢！

        參考文獻：

        1. Can stable isotope mass spectrometry replace nullradiolabelled approaches in metabolic studies?  http://dx.doi.org/doi:10.1016/j.plantsci.2016.05.011

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        5. Stable isotope-resolved metabolomics and applications for drug development. Pharmacology & Therapeutics, Volume 133, Issue 3, March 2012, Pages 366-391.

        6. The Use of Isotopically Labeled Compounds in Drug Discovery. Annual Reports in Medicinal Chemistry, Volume 44, 2009, Pages 515-534.

        7. 蛋白多肽類(lèi)藥物藥代動(dòng)力學(xué)分析方法研究進(jìn)展. CNKI

        8. 穩定性同位素標記試劑的研發(fā)及應用展望. CNKI

        9. **同位素標記藥物的制備方法.CNKI

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