RNAi療法因?yàn)槟軌蛴行О邢蚱胀ㄋ幬餆o(wú)法靶向的蛋白而成為醫(yī)藥界所關(guān)注的醫(yī)療手段。但是與其它靶向療法一樣，RNAi療法也會(huì)產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，而這些脫靶效應(yīng)可能造成嚴(yán)重的毒副作用。日前，Alnylam Pharmaceuticals公司的研究人員對(duì)N-乙酰半乳糖 (GalNAc) 綴合的RNAi 造成肝 臟毒副作用的機(jī)制進(jìn)行了詳盡的研究，并且找出降低這種RNAi療法脫靶效應(yīng)的簡(jiǎn)單方案。
GalNac能夠與肝細(xì)胞表面的去唾液酸糖蛋白受體 (asialoglycoprotein receptor，ASGPR) 結(jié)合并且轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)部，因此將GalNac綴合在RNAi 前體的末端能夠促使RNAi前體向肝 臟的靶向運(yùn)送。已有的對(duì)RNAi藥物的篩選方法大多聚焦于藥物的療效上，但是臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，很多GalNac綴合的RNAi候選藥物可能導(dǎo)致嚴(yán)重肝 臟毒副作用。因此，了解肝 臟毒副作用產(chǎn)生的原因并且修正對(duì)RNAi藥物的篩選標(biāo)準(zhǔn)，是開(kāi)發(fā)RNAi療法的生物技術(shù)公司需要解決的難題。
GalNac綴合的RNAi療法產(chǎn)生肝 臟毒副作用的原因可能有以下幾種：
RNAi藥物在肝細(xì)胞內(nèi)溶酶體 (endolysosome) 內(nèi)過(guò)度富集而干擾了內(nèi)溶酶體的正常功能；
用于提高RNAi藥物穩(wěn)定性的化學(xué)修飾可能產(chǎn)生**；
RNAi藥物的脫靶效應(yīng)。
Alnylam公司的研究人員首先通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)證明GalNac綴合的RNAi藥物的肝 臟毒副作用不是由于上述原因中的第一種和第二種造成的。RNAi 藥物被導(dǎo)入體內(nèi)時(shí)是以20~25個(gè)核苷酸的雙鏈RNAi前體的形式存在。這種RNAi前體需要與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體 (RNA-induced silencing complex，RISC) 結(jié)合, 并且被RISC處理后產(chǎn)生反義RNA片段才能行使它干擾mRNA轉(zhuǎn)譯的作用。
研究人員設(shè)計(jì)出一種RNAi前體，它雖然有和RNAi藥物相同的結(jié)構(gòu)和化學(xué)修飾，但是無(wú)法被RISC處理產(chǎn)生成熟的反義RNA片段。他們發(fā)現(xiàn)這種RNAi前體雖然依然能夠在內(nèi)溶酶體中富集，但是對(duì)肝細(xì)胞的**大幅度下降。這一結(jié)果表明干擾內(nèi)溶酶體功能不太可能是肝細(xì)胞**產(chǎn)生的原因。它同時(shí)意味著提高RNAi藥物穩(wěn)定性的化學(xué)修飾同樣不太可能是肝細(xì)胞**產(chǎn)生的原因。因?yàn)榇蟛糠諶NAi前體都沒(méi)有被RISC處理，它們依然保留著提高穩(wěn)定性的化學(xué)修飾。
▲RNAi的發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為是每十年一次的重大科學(xué)突破，它代表了當(dāng)今生物學(xué)和藥物研發(fā)領(lǐng)域最有前途和前沿的領(lǐng)域之一。（圖片來(lái)源：Alnylam Pharmaceuticals）
對(duì)mRNA轉(zhuǎn)譯的調(diào)控可以通過(guò)RNAi和microRNA兩種手段來(lái)進(jìn)行。RNAi通過(guò)與靶向mRNA的完全序列匹配導(dǎo)致mRNA被降解。而microRNA則通過(guò)與靶向mRNA的不完全序列匹配來(lái)抑制轉(zhuǎn)譯或者降低mRNA的穩(wěn)定性。RNAi療法中產(chǎn)生的反義RNA片段不但可以與靶向mRNA通過(guò)完全序列匹配而結(jié)合，還可能與其它mRNA通過(guò)不完全序列匹配進(jìn)行結(jié)合，從而產(chǎn)生類(lèi)似于microRNA的轉(zhuǎn)譯調(diào)節(jié)效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這一脫靶效應(yīng)恰恰是肝 臟**產(chǎn)生的原因。那么如何防止RNAi藥物的脫靶效應(yīng)呢？
因?yàn)镽NAi與mRNA序列的結(jié)合是通過(guò)完全序列匹配或幾乎完全序列匹配來(lái)完成的，所以更改RNAi序列中的一兩個(gè)核苷酸對(duì)結(jié)合效果的影響不大。而microRNA與mRNA的結(jié)合是通過(guò)不完全序列匹配來(lái)完成的，更改其中一兩個(gè)核苷酸會(huì)導(dǎo)致microRNA無(wú)法與靶點(diǎn)序列結(jié)合。研究人員利用了RNAi和microRNA與mRNA結(jié)合的不同機(jī)理，在他們?cè)O(shè)計(jì)的RNAi序列中故意加入了一個(gè)無(wú)法與任何堿基配對(duì)的核苷酸。這一改進(jìn)對(duì)RNAi與原有靶點(diǎn)的結(jié)合影響很小，但是大幅度降低了它以microRNA的作用方式調(diào)節(jié)其它mRNA轉(zhuǎn)錄的機(jī)會(huì)。這種改良同時(shí)顯著降低了RNAi藥物的肝 臟**。
雖然理論上RNAi療法以microRNA的作用方式產(chǎn)生脫靶效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)無(wú)法完全排除，但是這項(xiàng)研究開(kāi)發(fā)出的改良RNAi設(shè)計(jì)策略可能將RNAi療法在臨床試驗(yàn)中因?yàn)楦?臟**的失敗率從30~40%降低到5%左右。對(duì)于開(kāi)發(fā)RNAi療法的生物技術(shù)公司來(lái)說(shuō)無(wú)疑是值得采納的設(shè)計(jì)手段。
參考資料：
[1] Recognizing and Addressing Critical RNAi Off-targeting Issue
[2] Selection of GalNAc-conjugated siRNAs with limited off-target-driven rat hepatotoxicity
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