研究人員實(shí)現纖維小體原位關(guān)鍵酶的純化及解析

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2018-02-05

作為熱纖梭菌纖維小體中含量最高的的關(guān)鍵酶組分，Cel48S的酶學(xué)性質(zhì)及結構特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。團隊前期通過(guò)核磁共振方法修正了文獻中關(guān)于Cel48S的組裝模塊的結構，對纖維小體的組裝方式有了新認識。

纖維小體是細菌分泌的高效降解木質(zhì)纖維素的多酶復合體，其高效降解機制及產(chǎn)纖維小體細菌的遺傳改造是木質(zhì)纖維素降解利用研究中的重要方向之一。熱纖梭菌的Cel48S是其纖維小體的主要外切葡聚糖酶，是其纖維小體中含量的組分，在纖維素降解過(guò)程中起關(guān)鍵作用。但Cel48S的內在性質(zhì)使得對Cel48S的純化存在很大困難，文獻中對該酶的性質(zhì)鑒定報道存在諸多相互矛盾之處，與該酶在纖維小體中的重要作用并不相符，這使人們難以深入揭示纖維小體的高效降解機制。中國科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所代謝物組學(xué)團隊研究員崔球與馮銀剛、副研究員劉亞君等，基于前期開(kāi)發(fā)的熱纖梭菌遺傳改造工具，通過(guò)對纖維小體的定向改造，實(shí)現了對其原位Cel48S催化結構域的高效純化，從而成功的對Cel48S的酶學(xué)與結構性質(zhì)進(jìn)行系統解析，揭示Cel48S在纖維小體中的真正作用。相關(guān)成果在線(xiàn)發(fā)表在Biotechnology for Biofuels上。　　

木質(zhì)纖維素水解糖化是實(shí)現木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的高值利用的第一步，也是國內外的研究熱點(diǎn)。為了打破國外酶制劑技術(shù)壟斷、突破糖化技術(shù)瓶頸，代謝物組學(xué)團隊致力于開(kāi)發(fā)基于熱纖梭菌纖維小體的新型整合生物糖化技術(shù)路線(xiàn)。在這一路線(xiàn)框架下，需要通過(guò)對纖維小體這一多酶復合體的機制解析以及定向改良從而獲得高效的全菌催化劑。為此，代謝物組學(xué)團隊針對梭菌系統地開(kāi)發(fā)了非模式微生物基因操作工具，在熱纖梭菌中實(shí)現快速、準確的基因敲除、過(guò)表達和精準編輯，完成對熱線(xiàn)梭菌纖維小體腳架蛋白的功能貢獻、解除纖維小體反饋抑制的定向改造等系列工作。同時(shí)，團隊建立了成熟的X射線(xiàn)晶體學(xué)和生物大分子核磁共振等蛋白質(zhì)結構解析平臺，完成多個(gè)纖維小體組分和工業(yè)酶催化機制的研究。在完善的遺傳操作平臺和蛋白質(zhì)結構解析平臺的基礎之上，研究人員對纖維小體關(guān)鍵組分Cel48S進(jìn)行更系統深入的研究。

作為熱纖梭菌纖維小體中含量的的關(guān)鍵酶組分，Cel48S的酶學(xué)性質(zhì)及結構特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。團隊前期通過(guò)核磁共振方法修正了文獻中關(guān)于Cel48S的組裝模塊的結構，對纖維小體的組裝方式有了新認識。對于Cel48S的催化模塊，由于難于異源表達，與纖維小體結合緊密難以從原位分離，文獻中對其性質(zhì)的報道相互矛盾，該酶在纖維小體中的真正作用并未得到有效闡明。為了解決這一問(wèn)題，研究人員使用前期建立的熱纖梭菌精準遺傳操作工具，通過(guò)在Cel48S的催化結構域后面插入編碼組氨酸標簽和終止密碼子的序列，實(shí)現了將Cel48S的催化結構域從纖維小體中分離并從培養物上清中的一步直接純化。在此基礎上，通過(guò)酶學(xué)測定和蛋白質(zhì)結構分析，確定天然Cel48S的高活性、結晶纖維素的底物偏好以及底物偶聯(lián)的誘導契合效應，闡明纖維小體關(guān)鍵組分Cel48S的結構功能特性。同時(shí)，該研究提供了基于精準遺傳操作實(shí)現分離純化原位的纖維小體或其他分泌蛋白的方法，為進(jìn)一步研究纖維小體木質(zhì)纖維素降解機制及構建木質(zhì)纖維素糖化的定向改良菌株提供了范例和基礎。

相關(guān)系列研究得到了國家科技支撐計劃、國家自然科學(xué)基金委員會(huì )以及山東省糖產(chǎn)業(yè)科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室聯(lián)盟建設任務(wù)的資助。

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